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bb123456789

金虫 (正式写手)

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虫号: 1101928

[交流] western boltting技术求救

目前，本人正在做一个目标基因在各个发育时期和某一时期各个组织中的表达情况分析

在DNA水平，做TR-PCR验证在各个组织以及不同的发育时期均表达，但是做western blotting分析时，总没有目标带出来，用同样的抗体对纯化蛋白进行western blotting分析能出来目标带，不知道大家有没有遇到这样的问题？是怎么解决的呢？

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1楼 2013-12-19 23:05:12

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loveerobin

木虫 (职业作家)

应助: 27 (小学生)
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虫号: 1371932

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
bb123456789: 金币+1, 做了的，纯化蛋白带能出来，纯化蛋白上样量差不多0.5ug，在相同曝光时间下带很明显 2013-12-20 12:16:36

引用回帖:

8楼: Originally posted by bb123456789 at 2013-12-20 09:50:13
目前总蛋白的上样量是100-150ug，一抗稀释按1:7500稀释的，二抗也是按这个比例稀释的我们的PVDF膜孔径是0.45um，300mA湿转了一个半小时。会不会因为表达量低，转膜的时候转过了呢？...

有可能是表达量低，不大可能是转膜转过了
一抗稀释的有点厉害，如果一抗还多的话，减小一下稀释比例
下次做到时候，用纯化的目的蛋白点一个样，做对照