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向日葵gl

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化

最近在纯化鸡蛋中的OVT，以前一直很稳定的，但是从暑假开始就分不出来了，条带不干净，换了方法，还是不纯，又没有明显的杂带。怎么办，又没有前辈遇到过类似的问题，真心求教！！！
图上第一个是marker，第二、三、四是我纯化的蛋白，理论上来说，即使有杂带也不该是在阴影处。
蛋白纯化
2345截图20131129184332.png
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1楼 2013-11-29 18:53:18
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xiaomiao123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-30 12:16:35
向日葵gl: 金币+3, ★★★很有帮助, 确实是胶有问题，浓缩胶缓冲液被污染了 2013-11-30 17:50:24
是不是Ḃ胶片有问题？没有其他杂峰的话

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2013-11-29 19:12:26
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向日葵gl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaomiao123 at 2013-11-29 19:12:26
是不是Ḃ胶片有问题？没有其他杂峰的话

这块胶的分离胶浓度是12%的，换过10%和15%的，都不行。
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3楼2013-11-29 19:19:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-30 12:16:43
向日葵gl: 金币+2, ★有帮助 2013-11-30 17:50:48
样品用的什么方法纯化的？最终buffer的成分是什么？上样buffer是新配置的吗？
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4楼2013-11-30 08:54:18
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向日葵gl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-30 08:54:18
样品用的什么方法纯化的？最终buffer的成分是什么？上样buffer是新配置的吗？

柱材是DEAE Sepharose FF， 缓冲液是Tris-HCl, 目标蛋白是用缓冲液加盐洗脱，所有的溶液都是现配现用，洗脱峰分的很开，但是蛋白跑电泳却是这样的结果。我也试过改变盐浓度，但是结果都不理想。
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5楼2013-11-30 16:49:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 向日葵gl at 2013-11-30 16:49:16
柱材是DEAE Sepharose FF， 缓冲液是Tris-HCl, 目标蛋白是用缓冲液加盐洗脱，所有的溶液都是现配现用，洗脱峰分的很开，但是蛋白跑电泳却是这样的结果。我也试过改变盐浓度，但是结果都不理想。...

样品最后除盐了吗？盐浓度高了PAGE也会有很大影响。
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6楼2013-12-01 02:23:01
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
看起来条带有些往下拖尾
如果不是跑胶的问题的话,有可能是蛋白在纯化过程中被降解了
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
7楼2013-12-02 04:34:39
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Allen206

银虫 (小有名气)
取未纯化原样品跑一下，看阴影处是否有带，没有就是纯化过程中降解了，有就是杂带，换成15或30Q, 几种填料都试一下
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不想说什么，，，，
8楼2013-12-02 09:48:12
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