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向日葵gl

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化

最近在纯化鸡蛋中的OVT,以前一直很稳定的,但是从暑假开始就分不出来了,条带不干净,换了方法,还是不纯,又没有明显的杂带。怎么办,又没有前辈遇到过类似的问题,真心求教!!!
图上第一个是marker,第二、三、四是我纯化的蛋白,理论上来说,即使有杂带也不该是在阴影处。
蛋白纯化
2345截图20131129184332.png
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xiaomiao123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-11-30 12:16:35
向日葵gl: 金币+3, ★★★很有帮助, 确实是胶有问题,浓缩胶缓冲液被污染了 2013-11-30 17:50:24
是不是Ḃ胶片有问题?没有其他杂峰的话

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2013-11-29 19:12:26
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向日葵gl

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaomiao123 at 2013-11-29 19:12:26
是不是Ḃ胶片有问题?没有其他杂峰的话

这块胶的分离胶浓度是12%的,换过10%和15%的,都不行。
3楼2013-11-29 19:19:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-11-30 12:16:43
向日葵gl: 金币+2, 有帮助 2013-11-30 17:50:48
样品用的什么方法纯化的?最终buffer的成分是什么?上样buffer是新配置的吗?
4楼2013-11-30 08:54:18
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向日葵gl

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-30 08:54:18
样品用的什么方法纯化的?最终buffer的成分是什么?上样buffer是新配置的吗?

柱材是DEAE Sepharose FF, 缓冲液是Tris-HCl, 目标蛋白是用缓冲液加盐洗脱,所有的溶液都是现配现用,洗脱峰分的很开,但是蛋白跑电泳却是这样的结果。我也试过改变盐浓度,但是结果都不理想。
5楼2013-11-30 16:49:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 向日葵gl at 2013-11-30 16:49:16
柱材是DEAE Sepharose FF, 缓冲液是Tris-HCl, 目标蛋白是用缓冲液加盐洗脱,所有的溶液都是现配现用,洗脱峰分的很开,但是蛋白跑电泳却是这样的结果。我也试过改变盐浓度,但是结果都不理想。...

样品最后除盐了吗?盐浓度高了PAGE也会有很大影响。
6楼2013-12-01 02:23:01
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人

看起来条带有些往下拖尾
如果不是跑胶的问题的话,有可能是蛋白在纯化过程中被降解了
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
7楼2013-12-02 04:34:39
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Allen206

银虫 (小有名气)

取未纯化原样品跑一下,看阴影处是否有带,没有就是纯化过程中降解了,有就是杂带,换成15或30Q, 几种填料都试一下
不想说什么,,,,
8楼2013-12-02 09:48:12
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