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hospitals

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR的可重复性 已有4人参与

最近,做实验出现了特别诡异的事件,之前PCR扩增很是顺利,中间出差一周后再换了新溶的引物,就怎么也扩不出来了。
这期间,DNA检测没有问题,浓度在27-30ng/ul之间,260/280值在1.7-1.9之间;稀释了DNA到10倍,50倍,100倍;引物是新的,别人也试过,引物没有问题;PCRmix也是新的,也换过牌子;换过PCR仪;换过操作的人.......
真是百思不得其解啊,望高人指点迷津啊,不甚感激!

此外,我在N篇文献上找到别人扩增的引物和PCR条件,引物都是通用的,结果用到自己的实验上就总是没有结果,实验一再的在重复重复,无望中~~~
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nuliwangyu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-01-29 16:22:01
引用回帖:
9楼: Originally posted by hospitals at 2013-12-01 21:52:37
对,模板是gDNA,先说一下PCR重复的问题就是之前能够成功扩增的,这应该能说明引物没有问题吧。现在同样的条件就是无法扩增,换过高保真酶,也无济于事。一开始考虑了模板降解问题,也重新提过DNA,都不行。
再就 ...

第一个问题:我觉得您的模板可能已经讲解掉了,或者溶解引物出现问题。您方便上传下电泳图片吗?之前的和现在的。
第二个问题:如果能去除掉认为操作的原因;有的能扩出来,说明有这个基因;有的扩不出来说明没有这个基因。
27楼2013-12-27 13:41:01
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查看全部 28 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:33
模板是什么,gDNA?如何确定引物没有问题的?
文献上的PCR条件只能作为自己实验的参考,不要严格follow。PCR的条件在使用不同酶时会有少许差别。
2楼2013-11-29 14:23:21
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:38
我感觉一般的重复性是很好的 论坛里很多人重复自己以前的实验出了问题 还是自身找原因 试剂 样品 仪器
实在不行 去其他实验室做一下试试
海纳百川止于至善
3楼2013-11-29 15:08:07
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
换模板试一下说不定就行了
借你一生好不好
4楼2013-11-29 19:36:35
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