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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » 同时分离血小板和红细胞
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wangxding

新虫 (小有名气)

[求助] 同时分离血小板和红细胞

本人最近在做关于血小板和红细胞（灌胃给药大鼠的血浆）可能结合成分的研究，所以需要同时分离血小板和红细胞，由于完全是菜鸟，在查阅相关文献时学习到可能可行的两种方法，希望能获得相对纯的血小板和红细胞。下面是我遇到的疑惑，请各位多多指教，谢谢！
1、抗凝剂的选择：有的书上说肝素钠对血小板聚集有影响，如果需要同时分离血小板和红细胞的话，是不是最好选择枸橼酸钠？请教各位最好使用哪种抗凝剂能保持两者的活性。
2、分离方法猜想：a、差速离心：先将抗凝血用900rpm，室温离心1omin，吸取上层PRP，再将PRP以室温3000rpm离心10分钟，使血小板沉淀，将血小板用pH6.5的含EDTA0.2mmol/L的无Ca2+的Trode液洗涤3次，用pH7.4的PBS悬浮。另外，取下层血浆，加入3倍PBS液，3000r/min冷冻离心 10min，，弃上清液，反复洗涤三次，得到红细胞悬液，向红细胞悬液中以 1:80 比例加入预冷的 5mmol/L PH7.4Tris-HCl 溶液，同时加入蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟（PMSF），之后以 80Hz 20℃超声 15min，放入 4℃溶血过夜，将所得红细胞溶血液以 15000r/min 离心 10min,弃上清液，再加入 5mmol/L PH 7.4Tris-HCl 溶液以 15000r/min 离心 10min，反复洗涤3-5次，最后得到乳白色膜，将其1:1 悬浮在 PBS 溶液中。
b、用密度梯度离心：这部分只做了初步了解，还没有具体方案，希望各位能给些建议。
3、由于实验需要检测的是与血小板和红细胞膜结合的物质，会采用pH4的PBS洗脱血小板和红细胞膜，这种做法是否能够将结合成分洗脱，是否可行？有没有必要使红细胞溶血后得到红细胞膜悬液再洗脱？
4、蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟（PMSF）加入量应该为多少？
5、在洗涤红细胞膜时有的用Tris-HCL液也有Hank's液，两者哪个更好？
6、在做相关实验时所需要的仪器有哪些？比如是用EP管离心还是其他什么管？
7、刚开始离心时不用冷冻离心是否会对红细胞产生影响？
问题有点多再次多谢大家！
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1楼 2013-10-25 17:51:23
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yym123321

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你好，我也做血小板相关的实验，望相互联系讨论。
我用柠檬酸钠3.8%抗凝，然后以900 rpm 10 min 得到 PRP 再以 3000rpm 离心得到血小板，准备用PBS混悬，然后计数，希望对您有帮助，也希望你可以帮我参考下我 的方法可行不，谢谢
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wangxding
不要轻言放弃
12楼2013-11-13 18:08:39
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wangxding

新虫 (小有名气)
加油！顶自己！
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2楼2013-10-26 09:48:39
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wangxding

新虫 (小有名气)
诚心求助，望高手雪中送炭哇
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3楼2013-10-26 18:24:39
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RXMCDM

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
wangxding: 金币+15, ★有帮助 2013-10-28 19:06:51
如果需要同时分离血小板和红细胞的话，可选用CPD保存液，或EDTA K2,洗涤红细胞膜时用Hank's液，刚开始离心时不用冷冻离心会对红细胞产生影响,分离血小板和红细胞一般不用密度梯度离心！
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？
4楼2013-10-26 20:49:25
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wangxding

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by RXMCDM at 2013-10-26 20:49:25
如果需要同时分离血小板和红细胞的话，可选用CPD保存液，或EDTA K2,洗涤红细胞膜时用Hank's液，刚开始离心时不用冷冻离心会对红细胞产生影响,分离血小板和红细胞一般不用密度梯度离心！

你说的保存液是抗凝剂吗？如果用EDTA-K2作为抗凝剂的话那洗涤血小板时“含EDTA0.2mmol/L的无Ca2+的Trode液”就不太好定量了，现在我打算先自然沉降分离血小板然后再冷冻离心，这样应该红细胞影响较小了吧，谢谢你的回答！终于等到一个了，不容易！
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5楼2013-10-28 19:08:12
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RXMCDM

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【答案】应助回帖

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5楼: Originally posted by wangxding at 2013-10-28 19:08:12
你说的保存液是抗凝剂吗？如果用EDTA-K2作为抗凝剂的话那洗涤血小板时“含EDTA0.2mmol/L的无Ca2+的Trode液”就不太好定量了，现在我打算先自然沉降分离血小板然后再冷冻离心，这样应该红细胞影响较小了吧，谢谢你的 ...

保存液是枸橼酸钠抗凝加保存红细胞的成分！
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6楼2013-10-28 19:16:04
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wangxding

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by RXMCDM at 2013-10-28 19:16:04
保存液是枸橼酸钠抗凝加保存红细胞的成分！...

不好意思，再请教一下，我在过程中基本都是用PBS液进行洗涤的，您说得保存液是说在红细胞洗涤过程中或者处理后保存样品试用吗？
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7楼2013-10-28 19:36:56
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RXMCDM

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【答案】应助回帖

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7楼: Originally posted by wangxding at 2013-10-28 19:36:56
不好意思，再请教一下，我在过程中基本都是用PBS液进行洗涤的，您说得保存液是说在红细胞洗涤过程中或者处理后保存样品试用吗？...

不是啊，采血时需抗凝，要不血液会凝固，血小板和红细胞都破坏了。单加抗凝剂效果不好。所以加有其他成分。然后才分离血小板和红细胞。如果分离的成分不需回输，可用EDTA，如要回输给人或动物，CPD保存液不影响！
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8楼2013-10-28 19:49:43
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wangxding

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by RXMCDM at 2013-10-28 19:49:43
不是啊，采血时需抗凝，要不血液会凝固，血小板和红细胞都破坏了。单加抗凝剂效果不好。所以加有其他成分。然后才分离血小板和红细胞。如果分离的成分不需回输，可用EDTA，如要回输给人或动物，CPD保存液不影响！...

哦，明白了，不用回输的，除了EDTA有没有对血小板和红细胞都没有影响的抗凝剂呢？虽然我了解到的EDTA应用范围比较广，但是对“含EDTA0.2mmol/L的无Ca2+的Trode液”就不太好定量，您有何高见呢？
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9楼2013-10-28 19:56:15
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RXMCDM

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【答案】应助回帖

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wangxding: 金币+35 2013-11-27 21:29:15
引用回帖:
9楼: Originally posted by wangxding at 2013-10-28 19:56:15
哦，明白了，不用回输的，除了EDTA有没有对血小板和红细胞都没有影响的抗凝剂呢？虽然我了解到的EDTA应用范围比较广，但是对“含EDTA0.2mmol/L的无Ca2+的Trode液”就不太好定量，您有何高见呢？...

用枸橼酸钠！可以，如果分离所需时间段的话！
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wangxding
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10楼2013-10-28 20:02:21
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