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同时分离血小板和红细胞
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本人最近在做关于血小板和红细胞（灌胃给药大鼠的血浆）可能结合成分的研究，所以需要同时分离血小板和红细胞，由于完全是菜鸟，在查阅相关文献时学习到可能可行的两种方法，希望能获得相对纯的血小板和红细胞。下面是我遇到的疑惑，请各位多多指教，谢谢！ 1、抗凝剂的选择：有的书上说肝素钠对血小板聚集有影响，如果需要同时分离血小板和红细胞的话，是不是最好选择枸橼酸钠？请教各位最好使用哪种抗凝剂能保持两者的活性。 2、分离方法猜想：a、差速离心：先将抗凝血用900rpm，室温离心1omin，吸取上层PRP，再将PRP以室温3000rpm离心10分钟，使血小板沉淀，将血小板用pH6.5的含EDTA0.2mmol/L的无Ca2+的Trode液洗涤3次，用pH7.4的PBS悬浮。另外，取下层血浆，加入3倍PBS液，3000r/min冷冻离心 10min，，弃上清液，反复洗涤三次，得到红细胞悬液，向红细胞悬液中以 1:80 比例加入预冷的 5mmol/L PH7.4Tris-HCl 溶液，同时加入蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟（PMSF），之后以 80Hz 20℃超声 15min，放入 4℃溶血过夜，将所得红细胞溶血液以 15000r/min 离心 10min,弃上清液，再加入 5mmol/L PH 7.4Tris-HCl 溶液以 15000r/min 离心 10min，反复洗涤3-5次，最后得到乳白色膜，将其1:1 悬浮在 PBS 溶液中。 b、用密度梯度离心：这部分只做了初步了解，还没有具体方案，希望各位能给些建议。 3、由于实验需要检测的是与血小板和红细胞膜结合的物质，会采用pH4的PBS洗脱血小板和红细胞膜，这种做法是否能够将结合成分洗脱，是否可行？有没有必要使红细胞溶血后得到红细胞膜悬液再洗脱？ 4、蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟（PMSF）加入量应该为多少？ 5、在洗涤红细胞膜时有的用Tris-HCL液也有Hank's液，两者哪个更好？ 6、在做相关实验时所需要的仪器有哪些？比如是用EP管离心还是其他什么管？ 7、刚开始离心时不用冷冻离心是否会对红细胞产生影响？ 问题有点多再次多谢大家！ |
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