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晓风晨曦

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[求助] 高效液相梯度洗脱耐用性试验怎么做？求各位大神指教

现在在做一个项目，流动相初始比例是盐：甲醇（50:50），但是峰根本分不开，后来重新摸索了一套方法，流动相比例设成梯度的，峰是分开了，可是耐用性试验流动相比例该怎么调，麻烦各位大神指教下，谢谢

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1楼2013-10-23 09:48:51

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yi_wang

铁杆木虫 (著名写手)

roye

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【答案】应助回帖

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高效液相色谱(HPLC)在药品检验中使用越来越普遍，尤其是在药品的含量测定和有关物质检查方面。随着低压四元梯度HPLC仪的出现，使流动相的调整优化更加方便、快捷，更容易实现仪器的自动化操作，因此逐渐成为高效液相色谱仪的主流配置，给使用者带来极大的便利。许多流动相中往往含有缓冲盐，当使用低压四元梯度高效液相色谱仪，仪器按设定比例，由比例阀控制相应比例混合后，进行洗脱时，如果流动相没有考察耐用性，有时可能会在阀后有盐析出，且在到达柱前仍没有溶解，这样极易损坏活塞杆及堵塞柱子。实验中，作者发现：盐酸雷诺嗪有关物质检查及含量测定使用HPI C法，流动相为0．68 磷酸二氢钠(用三乙胺调pH 至6．5±0．1)溶液一乙腈(50：50)，使用比例阀将缓冲液和乙腈分别泵送时，实验不能正常进行。经查，是因0．68 NaH。PO 缓冲盐浓度偏高，当阀后二相相遇时NaH：PO 便析出。为此做了以下试验：分别配制浓度为0．68 和0．1 0A磷酸二氢钠水溶液，并用三乙胺调pH至6．5±0．1；取具塞带刻度离心管，分别按乙腈一磷酸二氢钠(pH6．5± 0．1)溶液不同比例混合，观察溶液的澄清度，溶液在黑背景下观察，以蒸馏水为空白对照。结果如下表：从表中可以看到，两相相遇时，开始都出现浑浊；充分振摇后，有机相乙腈比例低的流动相可溶解至澄清，但当缓冲盐的浓度偏高，即使振摇，析出的盐也不可能完全溶解。另外，即使预先将两相混合振摇后溶液澄清，但若缓冲盐的浓度太高，如果使用低压梯度泵分别泵送，有可能出现流动相混浊现象，而此时又不能被发现，此溶液进入到柱子中，轻者色谱图会出现怪峰，实验无法正常进行，严重时会堵柱子。通过上述讨论，作者认为，在质量标准中建立HPLC方法时，应注意：
1．在优化流动相组成时，尽可能降低缓冲盐浓度。
2．不同的实验室，试验条件有所差异，且柱子牌号不同，可能需要调整质量标准中规定的流动相的比例(这在质量标准中是允许的)。因此建议在耐用性实验时，必须对缓冲盐浓度在一定范围内的变化对流动相澄清度的影响等色谱耐用性进行考察。
3．等度洗脱时，应预先将流动相混合好，并经脱气后再使用。
还有一篇关于“加强HPLC流动相的耐用性试验研究”的文章，你可以看看。