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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 新药研发 » 质量控制 » 高效液相梯度洗脱耐用性试验怎么做？求各位大神指教
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晓风晨曦

新虫 (初入文坛)

[求助] 高效液相梯度洗脱耐用性试验怎么做？求各位大神指教

现在在做一个项目，流动相初始比例是盐：甲醇（50:50），但是峰根本分不开，后来重新摸索了一套方法，流动相比例设成梯度的，峰是分开了，可是耐用性试验流动相比例该怎么调，麻烦各位大神指教下，谢谢
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1楼2013-10-23 09:48:51
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飞燕-五星岩

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
晓风晨曦(zhychen2008代发): 金币+1, 多谢回帖交流 2013-10-23 21:40:36
这个可以不用做了，梯度洗脱没法调啊。
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我努力我成功
2楼2013-10-23 10:06:27
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yi_wang

铁杆木虫 (著名写手)

roye

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
高效液相色谱(HPLC)在药品检验中使用越来越普遍，尤其是在药品的含量测定和有关物质检查方面。随着低压四元梯度HPLC仪的出现，使流动相的调整优化更加方便、快捷，更容易实现仪器的自动化操作，因此逐渐成为高效液相色谱仪的主流配置，给使用者带来极大的便利。许多流动相中往往含有缓冲盐，当使用低压四元梯度高效液相色谱仪，仪器按设定比例，由比例阀控制相应比例混合后，进行洗脱时，如果流动相没有考察耐用性，有时可能会在阀后有盐析出，且在到达柱前仍没有溶解，这样极易损坏活塞杆及堵塞柱子。实验中，作者发现：盐酸雷诺嗪有关物质检查及含量测定使用HPI C法，流动相为0．68 磷酸二氢钠(用三乙胺调pH 至6．5±0．1)溶液一乙腈(50：50)，使用比例阀将缓冲液和乙腈分别泵送时，实验不能正常进行。经查，是因0．68 NaH。PO 缓冲盐浓度偏高，当阀后二相相遇时NaH：PO 便析出。为此做了以下试验：分别配制浓度为0．68 和0．1 0A磷酸二氢钠水溶液，并用三乙胺调pH至6．5±0．1；取具塞带刻度离心管，分别按乙腈一磷酸二氢钠(pH6．5± 0．1)溶液不同比例混合，观察溶液的澄清度，溶液在黑背景下观察，以蒸馏水为空白对照。结果如下表：从表中可以看到，两相相遇时，开始都出现浑浊；充分振摇后，有机相乙腈比例低的流动相可溶解至澄清，但当缓冲盐的浓度偏高，即使振摇，析出的盐也不可能完全溶解。另外，即使预先将两相混合振摇后溶液澄清，但若缓冲盐的浓度太高，如果使用低压梯度泵分别泵送，有可能出现流动相混浊现象，而此时又不能被发现，此溶液进入到柱子中，轻者色谱图会出现怪峰，实验无法正常进行，严重时会堵柱子。通过上述讨论，作者认为，在质量标准中建立HPLC方法时，应注意：
1．在优化流动相组成时，尽可能降低缓冲盐浓度。
2．不同的实验室，试验条件有所差异，且柱子牌号不同，可能需要调整质量标准中规定的流动相的比例(这在质量标准中是允许的)。因此建议在耐用性实验时，必须对缓冲盐浓度在一定范围内的变化对流动相澄清度的影响等色谱耐用性进行考察。
3．等度洗脱时，应预先将流动相混合好，并经脱气后再使用。
还有一篇关于“加强HPLC流动相的耐用性试验研究”的文章，你可以看看。
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哥泡的不是论坛,是寂寞....
3楼2013-10-23 10:15:53
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News

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
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晓风晨曦(zhychen2008代发): 金币+1, 多谢参与 2013-10-23 21:41:08
梯度的流动相组成真没法做。其他的你可以做做
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水滴石穿！！
4楼2013-10-23 12:30:56
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duliuhui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
晓风晨曦(zhychen2008代发): 金币+1, 多谢回帖交流 2013-10-23 21:41:30
看你的主峰或者说最难分离的峰保留时间在梯度的哪一段。
可以调整不同的初始比例，可以调整梯度变化速率等来考察耐用性。
其他如色谱柱、仪器、流动相pH、温度、流速等都可考察。
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5楼2013-10-23 16:18:54
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星海慧儿

荣誉版主 (职业作家)

木虫精灵

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
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晓风晨曦: 金币+2, ★有帮助, 好的 谢谢 2013-10-26 09:51:56
其实你在摸索梯度的同时已经对流动相组成有了选择和探讨，这是你已经对它的组成的耐受情况有了一定的了解了。
现在就是微小变动一下条件，验证一下该条件的实际耐受范围。如果你是高压梯度，初始流动相又是多组分，分别是是两两混合的，那么可以在混合时适当改变一下比例；如果是2组分未混合而由仪器混合，那么这个就可以不用再做了，因为这是仪器之间的重现性问题，会由重现性试验验证的。如果是低压梯度，可参考如上。
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我是超级天后：天天努力，不落人后！
6楼2013-10-24 10:10:04
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乐乐雪兔

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
耐用性，你问的是流动相比例耐用性试验吧？整个比例都按照正负2％调整。就可以啦…其他条件的耐用性跟以前等度洗脱一样呀…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好好学习专业知识······
7楼2013-10-24 10:29:40
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