| 查看: 17030 | 回复: 17 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
[求助]
WB结果膜总是黑成一片是怎么回事 已有1人参与
|
|||||
|
做WB整整有一个月了，结果都不好，主要是条带颜色淡，背景颜色深，有时甚至是整个黑成一片，根本看不到条带的影子，很是恼火。有尝试过换封闭液，增加封闭时间，增加洗膜次数，可结果依旧不好。现在的条件是5%的脱脂奶粉（光明），一抗孵育过夜，洗膜（TBST：Nacl 8.8g,1M PH7.5 Tris HCL 20ml，Tween 20 1ml,蒸馏水定容至1L）5min*5次，二抗孵育1h，请教给位大神，我的问题到底出在哪儿,是操作中还是真的是抗体不行呢？ 2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg 2.jpg  2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg  2.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有90人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有6人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- WB杂交用PBST+0.1%milk洗膜吗?
已经有5人回复
- WB转膜后出现的问题
已经有18人回复
- 最近做WB实验，膜总是很花
已经有13人回复
- 做wb，膜封闭后，用洗涤后再孵育一抗吗，还是封闭后直接孵育一抗？
已经有8人回复
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 专家考核, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:29:33
民爱桥: 金币+10, ★有帮助 2013-10-24 16:09:55
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 专家考核, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:29:33
民爱桥: 金币+10, ★有帮助 2013-10-24 16:09:55
|
背景太高了，原因与解决方法： 1.封闭不充分。延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）。 2. 一抗浓度过高 。增加一抗稀释倍数。 3.抗体孵育温度过高。4℃孵育。 4.二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应。设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 。 5.一抗或二抗与封闭剂有交叉反应。 在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 以减少交叉反应。 6.洗膜不充分。增加洗涤次数。 7.膜不合适。NC 膜比 PVDF 膜背景低。 8.膜干燥。保证充分的反应液，避免出现干膜现象。 |
4楼2013-10-23 11:13:01
niushuaiji
金虫 (正式写手)
不放弃的小鸟
- 应助: 44 (小学生)
- 金币: 44.2
- 散金: 151
- 红花: 4
- 帖子: 647
- 在线: 132.5小时
- 虫号: 1217078
- 注册: 2011-03-01
- 性别: GG
- 专业: 临床生物化学检验
2楼2013-10-23 10:19:39
ericyo918
至尊木虫 (知名作家)
- 应助: 156 (高中生)
- 金币: 15157.4
- 散金: 846
- 红花: 20
- 帖子: 5085
- 在线: 1447.8小时
- 虫号: 1808878
- 注册: 2012-05-10
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
3楼2013-10-23 10:19:53
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:30:02
民爱桥: 金币+10 2013-10-24 16:10:49
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:30:02
民爱桥: 金币+10 2013-10-24 16:10:49
|
我也是才开始做wb，共勉。 你们实验室有其他人做么？看看师兄师姐的情况，有的时候某一批配的试剂有问题大家都会出现类似的问题，否则就是自己实验要改进啦。 1、背景颜色深可能是封闭的问题，我因为每次做到晚上才转完膜，所以都是4度封闭过夜，这样反而背景比较浅。 还有压片压的时间短背景也会比较浅，但那需要条带很深。 2、条带浅可能是转膜没转好，一抗、二抗没有孵好。我们是一抗2.5h,二抗1.5h.如果发光液好的话，条带很深，只压一会就有正好的条带而且背景比较浅。 （我压时间长的片子背景都会有点深） |
5楼2013-10-23 11:45:01
