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WB结果膜总是黑成一片是怎么回事 已有1人参与
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做WB整整有一个月了，结果都不好，主要是条带颜色淡，背景颜色深，有时甚至是整个黑成一片，根本看不到条带的影子，很是恼火。有尝试过换封闭液，增加封闭时间，增加洗膜次数，可结果依旧不好。现在的条件是5%的脱脂奶粉（光明），一抗孵育过夜，洗膜（TBST：Nacl 8.8g,1M PH7.5 Tris HCL 20ml，Tween 20 1ml,蒸馏水定容至1L）5min*5次，二抗孵育1h，请教给位大神，我的问题到底出在哪儿,是操作中还是真的是抗体不行呢？ 2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg 2.jpg  2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg  2.jpg |
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ericyo918
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3楼2013-10-23 10:19:53
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2楼2013-10-23 10:19:39
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【答案】应助回帖
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背景太高了，原因与解决方法： 1.封闭不充分。延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）。 2. 一抗浓度过高 。增加一抗稀释倍数。 3.抗体孵育温度过高。4℃孵育。 4.二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应。设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 。 5.一抗或二抗与封闭剂有交叉反应。 在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 以减少交叉反应。 6.洗膜不充分。增加洗涤次数。 7.膜不合适。NC 膜比 PVDF 膜背景低。 8.膜干燥。保证充分的反应液，避免出现干膜现象。 |
4楼2013-10-23 11:13:01
【答案】应助回帖
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我也是才开始做wb，共勉。 你们实验室有其他人做么？看看师兄师姐的情况，有的时候某一批配的试剂有问题大家都会出现类似的问题，否则就是自己实验要改进啦。 1、背景颜色深可能是封闭的问题，我因为每次做到晚上才转完膜，所以都是4度封闭过夜，这样反而背景比较浅。 还有压片压的时间短背景也会比较浅，但那需要条带很深。 2、条带浅可能是转膜没转好，一抗、二抗没有孵好。我们是一抗2.5h,二抗1.5h.如果发光液好的话，条带很深，只压一会就有正好的条带而且背景比较浅。 （我压时间长的片子背景都会有点深） |
5楼2013-10-23 11:45:01
