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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » WB结果膜总是黑成一片是怎么回事
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民爱桥

铜虫 (小有名气)

[求助] WB结果膜总是黑成一片是怎么回事 已有1人参与

做WB整整有一个月了，结果都不好，主要是条带颜色淡，背景颜色深，有时甚至是整个黑成一片，根本看不到条带的影子，很是恼火。有尝试过换封闭液，增加封闭时间，增加洗膜次数，可结果依旧不好。现在的条件是5%的脱脂奶粉（光明），一抗孵育过夜，洗膜（TBST：Nacl 8.8g,1M PH7.5 Tris HCL 20ml，Tween 20 1ml,蒸馏水定容至1L）5min*5次，二抗孵育1h，请教给位大神，我的问题到底出在哪儿,是操作中还是真的是抗体不行呢？
2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg
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WB结果膜总是黑成一片是怎么回事
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WB结果膜总是黑成一片是怎么回事-1
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1楼 2013-10-23 09:45:20
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

展望明天

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-10-24 00:30:16
民爱桥: 金币+5 2013-10-24 16:11:27
我一般是一抗封闭一个小时，感觉你的一抗封闭时间太长了。还有的情况是抗体不好用，我这几天就碰到这种情况，一抗的蛋白，不同公司的抗体，杂出来的效果完全不一样，一个是单一条带，背景是白的，另一个漆黑一片
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standuporgohome,it'syourfuckingchoice,doyoustillrememberthereasonwhyyouarehere?
6楼2013-10-23 21:17:57
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zhanghan

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
15楼2013-10-26 15:25:31
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wodexinqin

铁杆木虫 (著名写手)

为卿痴狂 傻瓜帮帮主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
民爱桥: 金币+5 2013-10-27 09:06:27
民爱桥: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-07 09:26:53
你这种情况，如果是化学发光，不把膜上的多余液体除尽就去发光，是会产生这种背景的，在加发光液之前先用吸水纸把膜表面的多余液体吸干，膜放在平整干净透明的载体上，再去发光试试看。
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其实我对自己也并不十分了解……
16楼2013-10-26 19:37:54
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普通回帖

niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-23 10:39:13
民爱桥: 金币+5, ★有帮助 2013-10-24 16:08:19
用的什么水？换成超纯去离子水试试
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Tobeornottobe,that'saproblem
2楼2013-10-23 10:19:39
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-23 10:39:26
民爱桥: 金币+5 2013-10-24 16:10:03
背景太深的问题，缩短一抗时间试试。
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3楼2013-10-23 10:19:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 专家考核, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:29:33
民爱桥: 金币+10, ★有帮助 2013-10-24 16:09:55
背景太高了，原因与解决方法：
1.封闭不充分。延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）。
2. 一抗浓度过高 。增加一抗稀释倍数。
3.抗体孵育温度过高。4℃孵育。
4.二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应。设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 。
5.一抗或二抗与封闭剂有交叉反应。 在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 以减少交叉反应。
6.洗膜不充分。增加洗涤次数。
7.膜不合适。NC 膜比 PVDF 膜背景低。
8.膜干燥。保证充分的反应液，避免出现干膜现象。
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4楼2013-10-23 11:13:01
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茉莉梦梦

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:30:02
民爱桥: 金币+10 2013-10-24 16:10:49
我也是才开始做wb，共勉。
你们实验室有其他人做么？看看师兄师姐的情况，有的时候某一批配的试剂有问题大家都会出现类似的问题，否则就是自己实验要改进啦。
1、背景颜色深可能是封闭的问题，我因为每次做到晚上才转完膜，所以都是4度封闭过夜，这样反而背景比较浅。
    还有压片压的时间短背景也会比较浅，但那需要条带很深。
2、条带浅可能是转膜没转好，一抗、二抗没有孵好。我们是一抗2.5h,二抗1.5h.如果发光液好的话，条带很深，只压一会就有正好的条带而且背景比较浅。
（我压时间长的片子背景都会有点深）
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5楼2013-10-23 11:45:01
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
民爱桥: 金币+5 2013-10-24 16:12:35
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-26 22:05:50
一抗孵育过夜没问题。
从楼主提供的图片看，还是因为洗膜不充分造成的背景。第二张曝光时间，显影时间控制的还是合适的。
解决办法，增加洗膜TBST体积，延长洗膜时间到10分钟以上，洗膜摇床速度增大一些。
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7楼2013-10-24 10:37:50
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民爱桥

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by niushuaiji at 2013-10-23 10:19:39
用的什么水？换成超纯去离子水试试

刚开始用的蒸馏水，后来嫌麻烦，就换成蒸馏水了
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8楼2013-10-24 16:08:09
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民爱桥

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ericyo918 at 2013-10-23 10:19:53
背景太深的问题，缩短一抗时间试试。

我们这边还有同学做的，都是一抗孵育过夜的，结果都很好的呀
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9楼2013-10-24 16:09:14
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民爱桥

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 展望明天 at 2013-10-23 21:17:57
我一般是一抗封闭一个小时，感觉你的一抗封闭时间太长了。还有的情况是抗体不好用，我这几天就碰到这种情况，一抗的蛋白，不同公司的抗体，杂出来的效果完全不一样，一个是单一条带，背景是白的，另一个漆黑一片

我也非常怀疑是抗体的问题
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10楼2013-10-24 16:11:21
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