应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » WB结果膜总是黑成一片是怎么回事
181/2返回列表12下一页
查看: 17645  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

民爱桥

铜虫 (小有名气)

[求助] WB结果膜总是黑成一片是怎么回事 已有1人参与

做WB整整有一个月了，结果都不好，主要是条带颜色淡，背景颜色深，有时甚至是整个黑成一片，根本看不到条带的影子，很是恼火。有尝试过换封闭液，增加封闭时间，增加洗膜次数，可结果依旧不好。现在的条件是5%的脱脂奶粉（光明），一抗孵育过夜，洗膜（TBST：Nacl 8.8g,1M PH7.5 Tris HCL 20ml，Tween 20 1ml,蒸馏水定容至1L）5min*5次，二抗孵育1h，请教给位大神，我的问题到底出在哪儿,是操作中还是真的是抗体不行呢？
2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg
2.jpg
WB结果膜总是黑成一片是怎么回事
2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg


WB结果膜总是黑成一片是怎么回事-1
2.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累 蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-10-23 09:45:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

展望明天

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-10-24 00:30:16
民爱桥: 金币+5 2013-10-24 16:11:27
我一般是一抗封闭一个小时，感觉你的一抗封闭时间太长了。还有的情况是抗体不好用，我这几天就碰到这种情况，一抗的蛋白，不同公司的抗体，杂出来的效果完全不一样，一个是单一条带，背景是白的，另一个漆黑一片
赞一下(1人) 回复此楼
standuporgohome,it'syourfuckingchoice,doyoustillrememberthereasonwhyyouarehere?
6楼2013-10-23 21:17:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhanghan

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
15楼2013-10-26 15:25:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wodexinqin

铁杆木虫 (著名写手)

为卿痴狂 傻瓜帮帮主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
民爱桥: 金币+5 2013-10-27 09:06:27
民爱桥: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-07 09:26:53
你这种情况，如果是化学发光，不把膜上的多余液体除尽就去发光，是会产生这种背景的，在加发光液之前先用吸水纸把膜表面的多余液体吸干，膜放在平整干净透明的载体上，再去发光试试看。
赞一下(1人) 回复此楼
其实我对自己也并不十分了解……
16楼2013-10-26 19:37:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-23 10:39:13
民爱桥: 金币+5, ★有帮助 2013-10-24 16:08:19
用的什么水？换成超纯去离子水试试
赞一下 回复此楼
Tobeornottobe,that'saproblem
2楼2013-10-23 10:19:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-23 10:39:26
民爱桥: 金币+5 2013-10-24 16:10:03
背景太深的问题，缩短一抗时间试试。
赞一下 回复此楼
3楼2013-10-23 10:19:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 专家考核, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:29:33
民爱桥: 金币+10, ★有帮助 2013-10-24 16:09:55
背景太高了，原因与解决方法：
1.封闭不充分。延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）。
2. 一抗浓度过高 。增加一抗稀释倍数。
3.抗体孵育温度过高。4℃孵育。
4.二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应。设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 。
5.一抗或二抗与封闭剂有交叉反应。 在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 以减少交叉反应。
6.洗膜不充分。增加洗涤次数。
7.膜不合适。NC 膜比 PVDF 膜背景低。
8.膜干燥。保证充分的反应液，避免出现干膜现象。
赞一下 回复此楼
4楼2013-10-23 11:13:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

茉莉梦梦

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:30:02
民爱桥: 金币+10 2013-10-24 16:10:49
我也是才开始做wb，共勉。
你们实验室有其他人做么？看看师兄师姐的情况，有的时候某一批配的试剂有问题大家都会出现类似的问题，否则就是自己实验要改进啦。
1、背景颜色深可能是封闭的问题，我因为每次做到晚上才转完膜，所以都是4度封闭过夜，这样反而背景比较浅。
    还有压片压的时间短背景也会比较浅，但那需要条带很深。
2、条带浅可能是转膜没转好，一抗、二抗没有孵好。我们是一抗2.5h,二抗1.5h.如果发光液好的话，条带很深，只压一会就有正好的条带而且背景比较浅。
（我压时间长的片子背景都会有点深）
赞一下 回复此楼
5楼2013-10-23 11:45:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
民爱桥: 金币+5 2013-10-24 16:12:35
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-26 22:05:50
一抗孵育过夜没问题。
从楼主提供的图片看，还是因为洗膜不充分造成的背景。第二张曝光时间，显影时间控制的还是合适的。
解决办法，增加洗膜TBST体积，延长洗膜时间到10分钟以上，洗膜摇床速度增大一些。
赞一下 回复此楼
7楼2013-10-24 10:37:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

民爱桥

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by niushuaiji at 2013-10-23 10:19:39
用的什么水？换成超纯去离子水试试

刚开始用的蒸馏水，后来嫌麻烦，就换成蒸馏水了
赞一下 回复此楼
8楼2013-10-24 16:08:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

民爱桥

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ericyo918 at 2013-10-23 10:19:53
背景太深的问题，缩短一抗时间试试。

我们这边还有同学做的，都是一抗孵育过夜的，结果都很好的呀
赞一下 回复此楼
9楼2013-10-24 16:09:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

民爱桥

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 展望明天 at 2013-10-23 21:17:57
我一般是一抗封闭一个小时，感觉你的一抗封闭时间太长了。还有的情况是抗体不好用，我这几天就碰到这种情况，一抗的蛋白，不同公司的抗体，杂出来的效果完全不一样，一个是单一条带，背景是白的，另一个漆黑一片

我也非常怀疑是抗体的问题
赞一下 回复此楼
10楼2013-10-24 16:11:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 民爱桥 的主题更新
181/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +6 雨打竹帘 2026-08-30 10/500 2026-08-31 09:29 by huixian257
[基金申请] 基金不中，共勉 +12 eulota 2026-08-26 12/600 2026-08-31 08:42 by ZJTJZ
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭