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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序问题
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blueghost2

新虫 (小有名气)

[求助] 测序问题

我做的实验是重组载体的构建，双酶切验证都是对的，然后测序测了好多次，每次都是说有重叠现象导致不能测序，我问测序公司什么是重叠现象，他说样本中干扰较大测序失败，真是纠结都测了一个多月了，那位高人指点一下啊！！！！！！急急急！！！！！
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1楼 2013-10-09 10:39:03
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wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换个公司测序吧，实在不行就双酶切后测你的酶切片段
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2楼2013-10-09 11:13:53
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-09 14:16:52
是不是你的目的蛋白有比较接近的isoform啊，我最近在构建一个质粒，双酶切没问题，但是把质粒做模板PCR的时候，隐约看到是两条相近的带重叠在一起。因为序列很接近，没办法分离开，然后测序的时候就经常测不出来，因为我是自己测序，所以我反复多次分节测序，才基本确定获得的目的条带是我需要的…
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生活是美好的
3楼2013-10-09 11:47:12
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuyao0513 at 2013-10-09 11:13:53
换个公司测序吧，实在不行就双酶切后测你的酶切片段

换过一次，说是没信号
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4楼2013-10-09 16:55:49
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nuoyaeva at 2013-10-09 11:47:12
是不是你的目的蛋白有比较接近的isoform啊，我最近在构建一个质粒，双酶切没问题，但是把质粒做模板PCR的时候，隐约看到是两条相近的带重叠在一起。因为序列很接近，没办法分离开，然后测序的时候就经常测不出来，因 ...

应该不是，我PCR验证时的条带就一条，你能自己测序？
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5楼2013-10-09 16:57:09
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r529887327

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
blueghost2: 金币+2, ★有帮助 2013-10-10 10:28:00
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-10 12:21:07
我觉得可能的原因：
1. 非单克隆；
2. 测序引物有非特异性退火；
3. 序列中存在回文结构。。。
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6楼2013-10-09 17:50:26
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
blueghost2: 金币+5, ★有帮助 2013-10-10 10:27:47
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-10 12:21:12
引用回帖:
5楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-10-09 17:57:09
应该不是，我PCR验证时的条带就一条，你能自己测序？...

我们实验室有部分实验会涉及检测突变情况，所以我们自己有2台测序仪器。我看了楼上说的，其中第二点，如果PCR产物很干净，那测序基本就不会有问题，可排除；至于回纹结构，那个更不是问题了，我经常检测B细胞S区和V区的突变情况，基本上属于重复序列最多的sequence，的确回纹结构以及重复序列会产生干扰，但是不会完全测不出来，我觉得也不太可能是这种情况。想来想去，觉得只有这种分子量基本一致的isoform，或者是你样本不纯。
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生活是美好的
7楼2013-10-09 20:19:12
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by r529887327 at 2013-10-09 17:50:26
我觉得可能的原因：
1. 非单克隆；
2. 测序引物有非特异性退火；
3. 序列中存在回文结构。。。

第一条我可以排除，因为我以前以为自己挑斑的时候不小心挑到两个斑，但后来我很注意这方面，应该不会出错。第二三条自己不是太懂，但看楼下的解释觉得有道理，应该也可以排除。
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8楼2013-10-10 09:32:21
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by nuoyaeva at 2013-10-09 20:19:12
我们实验室有部分实验会涉及检测突变情况，所以我们自己有2台测序仪器。我看了楼上说的，其中第二点，如果PCR产物很干净，那测序基本就不会有问题，可排除；至于回纹结构，那个更不是问题了，我经常检测B细胞S区和 ...

分子量一致的可能性不大，因为我要双酶切。非目的基因不可能那么巧也有这两个酶切位点，所以和载体链接的可能性就更小了。样本不纯，这个我也考虑了，觉得可能是杂菌污染，但后来我也很注意这方面，应该不会每次都污染，再说里面都有抗生素，其它菌也不容易生长啊，哎，怎么这么悲剧，竟遇见这种情况。。。现在我考虑的是测序用的引物是否有问题，但是测序公司用的是通用引物，说我的引物没问题，我现在就更纠结了。。。。。。。
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9楼2013-10-10 09:38:41
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
blueghost2: 金币+3 2013-10-11 09:45:46
引用回帖:
9楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-10-10 10:38:41
分子量一致的可能性不大，因为我要双酶切。非目的基因不可能那么巧也有这两个酶切位点，所以和载体链接的可能性就更小了。样本不纯，这个我也考虑了，觉得可能是杂菌污染，但后来我也很注意这方面，应该不会每次都 ...

那你可以尝试从不同的位点测序，如果你目的条带的分子量不大，你可以在70%的位置设计一个反向引物，往上游测序，在30%处设计一个正向引物，往下游测。
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生活是美好的
10楼2013-10-11 09:29:14
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