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blueghost2

新虫 (小有名气)

[求助] 测序问题

我做的实验是重组载体的构建,双酶切验证都是对的,然后测序测了好多次,每次都是说有重叠现象导致不能测序,我问测序公司什么是重叠现象,他说样本中干扰较大测序失败,真是纠结都测了一个多月了,那位高人指点一下啊!!!!!!急急急!!!!!
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
blueghost2: 金币+3 2013-10-11 09:45:46
引用回帖:
9楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-10-10 10:38:41
分子量一致的可能性不大,因为我要双酶切。非目的基因不可能那么巧也有这两个酶切位点,所以和载体链接的可能性就更小了。样本不纯,这个我也考虑了,觉得可能是杂菌污染,但后来我也很注意这方面,应该不会每次都 ...

那你可以尝试从不同的位点测序,如果你目的条带的分子量不大,你可以在70%的位置设计一个反向引物,往上游测序,在30%处设计一个正向引物,往下游测。
生活是美好的
10楼2013-10-11 09:29:14
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wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
换个公司测序吧,实在不行就双酶切后测你的酶切片段
2楼2013-10-09 11:13:53
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-09 14:16:52
是不是你的目的蛋白有比较接近的isoform啊,我最近在构建一个质粒,双酶切没问题,但是把质粒做模板PCR的时候,隐约看到是两条相近的带重叠在一起。因为序列很接近,没办法分离开,然后测序的时候就经常测不出来,因为我是自己测序,所以我反复多次分节测序,才基本确定获得的目的条带是我需要的…
生活是美好的
3楼2013-10-09 11:47:12
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wuyao0513 at 2013-10-09 11:13:53
换个公司测序吧,实在不行就双酶切后测你的酶切片段

换过一次,说是没信号
4楼2013-10-09 16:55:49
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