应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新手做原核表达 求帮忙
52/1返回列表
查看: 2138  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

862202686

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新手做原核表达 求帮忙

老师让我做效应蛋白原核表达，只是给了我一个蛋白序列的登陆号，其他自己摸索。 在看文献问百度之后，了解了效应蛋白，明白了原核表达的基本步骤。梳理一下：
1.提RNA。（因为是真菌，有内含子，只能反转录。）
2.设计引物。
3.反转录PCR。
4.连接T载体，转入感受态，挑阳性克隆送去测序，验证所得序列是否正确。
5.假设序列正确，提质粒，酶切，连接表达载体，转入表达菌。
不知道这样的步骤有哪些地方有错误或者不合理，希望大家给予指正，万分感谢。
还有，我现在想要设计引物，因为老师只给了一个蛋白序列的登录号，我水平有限，在NCBI上只能获得该氨基酸序列对应的cDNA序列，并不能获得完整的cDNA序列，因为没有两端的序列，我就不能设计引物，求帮助！
我是新虫，只有21个金币，真心感谢大神们的帮助指导！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2013-09-25 21:51:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

862202686

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by chenyuqin at 2013-09-26 21:23:17
在NCBI上只能获得该氨基酸序列对应的cDNA序列,没说清楚，是不是包含完整的ORF呢，如果是，直接拿ORF设计引物构建载体就OK了；不是的话，先拿全长再继续喽。...

感谢 是完整的ORF 不好意思 没说清楚

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
18楼2013-09-27 01:36:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答

淘淘279

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香分子生物期待你的精彩 2013-09-26 00:04:43
内含子个数不多的话也可以提基因组，把蛋白对应的这段基因通过pcr拿下来，再设计引物把内含子p掉。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
你能做的永远不止这些！
2楼2013-09-25 22:24:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenyuqin

新虫 (小有名气)
可以拿ORF设计；或者用BLAST分析一下找对应基因然后设计
赞一下 回复此楼
where there is a will,there ia a way.
3楼2013-09-25 22:26:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

862202686

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 淘淘279 at 2013-09-25 22:24:58
内含子个数不多的话也可以提基因组，把蛋白对应的这段基因通过pcr拿下来，再设计引物把内含子p掉。

非常感谢您，但是这样做可能会比较麻烦啊
赞一下 回复此楼
4楼2013-09-26 09:43:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] FileCode能看出啥？ +8 要乐观耀哥 2026-08-10 23/1150 2026-08-13 00:35 by 要乐观耀哥
[基金申请] 好奇怪的filecode +5 布布和一二 2026-08-08 6/300 2026-08-12 16:11 by 云上清扬
[基金申请] 长年满屏的广告，版主太不责任了。基金也等的急 +4 gltch 2026-08-12 4/200 2026-08-12 16:08 by eulota
[基金申请] filecode +13 documentary 2026-08-10 15/750 2026-08-12 15:56 by 云上清扬
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 13/650 2026-08-11 09:49 by 家与远方
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭