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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个4kb水稻基因的全长cDNA拉不出来!!求指教！
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昺昺

木虫 (小有名气)

[求助] 一个4kb水稻基因的全长cDNA拉不出来!!求指教！

各位大虾，我有一个水稻中的4kb的基因，想把它的全长cDNA拉出来，在RGAP这个数据库中查到它本身的表达水平很低，用尽了各种方法、各种高保真酶，效果都不好，烦请高手不吝指教一二！十分感谢！
  拼接的方法我也用过，分三段都能P出相应大小的片段，但混在一起P就不行了
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太阳出来，星星要走。
1楼 2013-09-21 08:00:37
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回帖置顶 ( 共有2个 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

amisking: 回帖置顶 2013-09-21 17:46:09
内容已删除
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5楼2013-09-21 11:09:18
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raygene_bio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 15:58:31
gyesang: 回帖置顶 2013-09-28 15:58:34
昺昺: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-09-29 08:35:17
首先需要确定3个片段是否都是您要的目的基因条带，可以分别先连入T载体测序看看。如果都是正确的，仅仅是因为PCR P不出来，那么需要考虑的问题则包括：如果搭桥PCR引物的设计问题，可以选择降温PCR来进行扩增（Touch down PCR）；如果是因为选用的DNA聚合酶不当，不能够进行4K片段的扩增，可以考虑长链扩增的酶（LA taq）。4K不算长，由于序列GC含量高导致的PCR扩增效率低的可能性一般比较大。建议可以考虑Touch down PCR来进行扩增。前面说的应用酶切位点来连接的也是好办法，就是不知序列中是否有合适的酶切位点。
4K的片段比较长，如果得到的3个片段不是目的基因片段，他们之间根本没有overlap，那PCR自然P不到，建议可以选择长链逆转录酶（promega有的）进行逆转录cDNA，再进行扩增。
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上海锐劲生物技术有限公司 http://www.raygene.com 021-54489928
18楼2013-09-28 12:57:51
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普通回帖

Fleaves

至尊木虫 (著名写手)
我也是啊！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-09-21 09:48:54
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Fleaves at 2013-09-21 09:48:54
我也是啊！

你用过那些方法和高保真酶啊？
我们一起等高人指点吧
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太阳出来，星星要走。
3楼2013-09-21 10:00:18
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-21 15:12:28
昺昺: 金币+1, ★有帮助 2013-09-21 18:01:44
“拼接的方法我也用过，分三段都能P出相应大小的片段，但混在一起P就不行了。”那么可能可能是因为混在一起时的三段的引物之间形成了二聚体，所以PCR不出来。
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4楼2013-09-21 10:27:53
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wahogui

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-21 15:12:41
昺昺: 金币+1, ★有帮助 2013-09-21 18:01:53
你可以找公司合成
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6楼2013-09-21 13:34:01
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+1, ★有帮助 2013-09-21 18:02:02
Takara的Primary star 楼主用过吗？overlapping在一块可以吗?
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jiayoubashaonian
7楼2013-09-21 15:43:59
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by blackrose8089 at 2013-09-21 15:43:59
Takara的Primary star 楼主用过吗？overlapping在一块可以吗?

谢谢！我用过了，效果不好啊
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太阳出来，星星要走。
8楼2013-09-21 18:00:42
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-21 21:23:40
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-23 09:51:11
可以尝试找一下目的片段内部有哪些酶切位点，在这个位置设置分段，然后用连接酶连在一起。
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9楼2013-09-21 21:12:16
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wangpeng227 at 2013-09-21 21:12:16
可以尝试找一下目的片段内部有哪些酶切位点，在这个位置设置分段，然后用连接酶连在一起。

非常感谢！就是直接对PCR产物进行T4连接吗？有没有具体的参考文献之类的，多谢！
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太阳出来，星星要走。
10楼2013-09-21 21:24:51
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