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[求助]
一个4kb水稻基因的全长cDNA拉不出来!!求指教！
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各位大虾，我有一个水稻中的4kb的基因，想把它的全长cDNA拉出来，在RGAP这个数据库中查到它本身的表达水平很低，用尽了各种方法、各种高保真酶，效果都不好，烦请高手不吝指教一二！十分感谢！ 拼接的方法我也用过，分三段都能P出相应大小的片段，但混在一起P就不行了 |
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 核酸生物学实验经验 |
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5楼2013-09-21 11:09:18
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昺昺: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-09-29 08:35:17
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首先需要确定3个片段是否都是您要的目的基因条带，可以分别先连入T载体测序看看。如果都是正确的，仅仅是因为PCR P不出来，那么需要考虑的问题则包括：如果搭桥PCR引物的设计问题，可以选择降温PCR来进行扩增（Touch down PCR）；如果是因为选用的DNA聚合酶不当，不能够进行4K片段的扩增，可以考虑长链扩增的酶（LA taq）。4K不算长，由于序列GC含量高导致的PCR扩增效率低的可能性一般比较大。建议可以考虑Touch down PCR来进行扩增。前面说的应用酶切位点来连接的也是好办法，就是不知序列中是否有合适的酶切位点。 4K的片段比较长，如果得到的3个片段不是目的基因片段，他们之间根本没有overlap，那PCR自然P不到，建议可以选择长链逆转录酶（promega有的）进行逆转录cDNA，再进行扩增。 |
18楼2013-09-28 12:57:51
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4楼2013-09-21 10:27:53
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