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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个4kb水稻基因的全长cDNA拉不出来!!求指教！
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
昺昺: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-22 08:16:42
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-23 09:45:04
引用回帖:
10楼: Originally posted by 昺昺 at 2013-09-21 21:24:51
非常感谢！就是直接对PCR产物进行T4连接吗？有没有具体的参考文献之类的，多谢！...

直接连接可能比较困难，可以分段扩增后，分别连入T载体，TA克隆的效率比较高，相对来说容易成功（请参考promega，TAKARA或者transgen公司的TA克隆载体）

对含有一个片段的TA克隆进行酶切，连入另一个目的片段，就可以得到全长的cDNA

建议找一个目的片段内部存在的酶切位点作为分段的位置，这样最后得到的全长cDNA序列不含有多余的碱基。

另外建议查一下水稻的表达谱芯片数据，可以看一下你的目的基因在那些组织中表达量比较高。可以挑选这个组织得到丰度较高的模板。
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11楼2013-09-21 23:32:21
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稻子

金虫 (小有名气)
挑个BAC克隆扩
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12楼2013-09-23 05:46:41
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2008101111

金虫 (正式写手)

学术江湖混子

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-24 17:34:32
实在不行就设计引物用重叠PCR方法拼接起来
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自主创业者，捣腾生物试剂
13楼2013-09-23 18:15:47
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 2008101111 at 2013-09-23 18:15:47
实在不行就设计引物用重叠PCR方法拼接起来

这个方法我也用过，分成三段可以P出来，但混合在一起就不行了，有哪些要点我没注意到吗？求指教
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太阳出来，星星要走。
14楼2013-09-24 09:50:05
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稀释浓硫酸

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你这4K是基因组大小，还是cDNA大小？我现在一个10K的基因，分两段扩出来了，打算后续用两个片段的重叠区特异酶切位点进行酶切，然后再拼接，不知道行不行，仅供参考。
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就算在地狱，也要建立属于自己的天堂！
15楼2013-09-24 10:53:04
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 稀释浓硫酸 at 2013-09-24 10:53:04
你这4K是基因组大小，还是cDNA大小？我现在一个10K的基因，分两段扩出来了，打算后续用两个片段的重叠区特异酶切位点进行酶切，然后再拼接，不知道行不行，仅供参考。

你这么做太麻烦，直接做overlap PCR就可以了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
16楼2013-09-24 17:35:16
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稀释浓硫酸

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by gyesang at 2013-09-24 17:35:16
你这么做太麻烦，直接做overlap PCR就可以了...

overlap 之后片段有10K多，连不到载体上，所以才想着这么弄，就是不知道有没有什么好一占的载体能够直接连的上的，那样就是最好的了。
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就算在地狱，也要建立属于自己的天堂！
17楼2013-09-28 12:41:06
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raygene_bio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 15:58:31
gyesang: 回帖置顶 2013-09-28 15:58:34
昺昺: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-09-29 08:35:17
首先需要确定3个片段是否都是您要的目的基因条带，可以分别先连入T载体测序看看。如果都是正确的，仅仅是因为PCR P不出来，那么需要考虑的问题则包括：如果搭桥PCR引物的设计问题，可以选择降温PCR来进行扩增（Touch down PCR）；如果是因为选用的DNA聚合酶不当，不能够进行4K片段的扩增，可以考虑长链扩增的酶（LA taq）。4K不算长，由于序列GC含量高导致的PCR扩增效率低的可能性一般比较大。建议可以考虑Touch down PCR来进行扩增。前面说的应用酶切位点来连接的也是好办法，就是不知序列中是否有合适的酶切位点。
4K的片段比较长，如果得到的3个片段不是目的基因片段，他们之间根本没有overlap，那PCR自然P不到，建议可以选择长链逆转录酶（promega有的）进行逆转录cDNA，再进行扩增。
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上海锐劲生物技术有限公司 http://www.raygene.com 021-54489928
18楼2013-09-28 12:57:51
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