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兽疫链球菌马疫链球菌基因组DNA提取 已有1人参与
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兽疫链球菌马疫链球菌基因组DNA提取时，因为具有荚膜等多糖成分，在通过生工试剂盒提取的过程中，是否会导致基因组DNA提取不纯，以及解决办法。 亲，希望能够完整回答问题，拿金币是要负责人滴！！！ |
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【答案】应助回帖
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lvsihan(kx444555代发): 金币+1, 鼓励交流 2013-10-16 10:27:49
lvsihan(kx444555代发): 金币+1, 鼓励交流 2013-10-16 10:27:49
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细菌基因组DNA的制备 一、材料 细菌培养物。 二、设备 移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 三、试剂 1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 四、操作步骤： 1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 质粒DNA的提取与纯化 -------------------------------------------------------------------------------- 质粒DNA的提取和纯化 1 质粒DNA的提取 质粒DNA是细菌细胞中小的共价闭合环状双链DNA。由于基因工程中使用的载体主要是质粒，因此，质粒DNA的提取和纯化是进行基因工程的重要前提。提取质粒DNA的方法很多，下面介绍几种有代表性的程序。 1)酚提取法 2)碱提取法 其基本原理是在溶菌酶和SDS破壁释放DNA后，在强碱条件下，DNA变性成单链，当加醋酸钠(NaAc)适当中和pH时，质粒DNA复性；而Ch-DNA和大分子RNA仍为单链并与蛋白质-SDS复合物被高盐沉淀，质粒DNA留在溶液中。不需经酚氯仿抽提，即可直接用乙醇沉淀上请中的p-DNA)。 3)煮沸提取法 此法快速简便，既可小规模检验也可大规模制备质粒DNA。其基本原理是在溶菌酶和Triton破壁释放DNA后，迅速煮沸，使Ch-DNA和蛋白质沉淀，质粒DNA留在溶液中。 2 质粒DNA的纯化(PCR产物的纯化) (1)加入0.1倍体积的10×STE缓冲液 ⑵ 加入等体积的4 mol/L NH4Ac ⑶ 加入2.5倍体积室温放置的无水乙醇 ⑷ 立即在室温下12 000r/min, 离心10 min，使DNA沉淀，小心地去掉上清 ⑸ 加入200μl的70%（V/V）乙醇 ⑹ 室温下12 000r/min, 离心10 min，小心地去掉上清，干燥 ⑺ 用与原样品体积相等（或减小体积以使样品浓缩）的TE缓冲液重悬DNA，放置4℃待用, 或-20℃贮存。 来源：百博明创（北京） |
2楼2013-10-16 10:26:52
3楼2017-01-03 12:10:32
