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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取椎间盘髓核组织RNA，A260/208＜1.5，A230峰值远高于A260、A280峰值,
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hymuanguing

新虫 (初入文坛)

[求助] 提取椎间盘髓核组织RNA，A260/208＜1.5，A230峰值远高于A260、A280峰值,

我提取椎间盘髓核组织RNA，使用的是天根的试剂盒TRNzolA+总RNA提取试剂，结果很是奇怪：A260/208＜1.5，A230峰值远高于A260、A280峰值,（见图片）。
   然后我换用同学的小鼠肺组织，使用同一试剂盒提取RNA，等到的结果就比较理想：A260/208在1.7-1.8之间。
    所以我推断是自己椎间盘髓核组织的问题。椎间盘髓核组织富含蛋白多糖和纤维成分，髓核细胞分散在细胞间质内，细胞数量比较少。不过我查阅相关文献，前辈们也是使用 Trizol 等提取总RNA的试剂成功提取了髓核细胞的RNA。  到这里就不行了。
    想请教的是：1、是否需要更换提取RNA的试剂盒（例如Invitrogen 的 TRizol ,或者是提取组织微量RNA的相关试剂盒等）？

                         2、如果不更换试剂盒的话，该如何优化实验呢，椎间盘髓核组织是否需要特殊处理呢？

                        3、或者还有什么其他方法，希望大家多给提提意见！
提取椎间盘髓核组织RNA，A260/208＜1.5，A230峰值远高于A260、A280峰值,
截图01.20130908.png


提取椎间盘髓核组织RNA，A260/208＜1.5，A230峰值远高于A260、A280峰值,-1
截图04.20130908.png
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1楼 2013-09-08 21:48:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-09 20:13:52
A280是检测样品中的蛋白含量，不是208，A260/280低说明蛋白残余比较多，可能与样品组织中蛋白含量高有关。A230高说明样品中的有机物多。TRIZOL是含酚的缓冲液，洗涤时还要用到乙醇，LZ的样品A230过高有可能是操作上的问题。有时候核酸样品浓度低也可能造成痕量有机试剂对A260/230影响很大。
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2楼2013-09-08 23:53:58
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hymuanguing

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-08 23:53:58
A280是检测样品中的蛋白含量，不是208，A260/280低说明蛋白残余比较多，可能与样品组织中蛋白含量高有关。A230高说明样品中的有机物多。TRIZOL是含酚的缓冲液，洗涤时还要用到乙醇，LZ的样品A230过高有可能是操作上 ...

如果是“核酸样品浓度低也可能造成痕量有机试剂对A260/230影响很大” ，那有什么好的解决方法吗
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3楼2013-09-09 09:30:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by hymuanguing at 2013-09-09 09:30:35
如果是“核酸样品浓度低也可能造成痕量有机试剂对A260/230影响很大” ，那有什么好的解决方法吗...

用适量的初始材料提取有助于改善最终样品的质量。关键还是提取过程要小心，尽量不要吸到有机试剂部分。洗涤后尽量把乙醇挥发干净。
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4楼2013-09-09 13:25:20
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hymuanguing

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-09 13:25:20
用适量的初始材料提取有助于改善最终样品的质量。关键还是提取过程要小心，尽量不要吸到有机试剂部分。洗涤后尽量把乙醇挥发干净。...

操作中可以保证没有吸到有机层。洗涤中可能有些许乙醇残留，不过残留的乙醇应该不会影响到A230、A260、A280的比值吧
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5楼2013-09-09 19:07:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by hymuanguing at 2013-09-09 19:07:14
操作中可以保证没有吸到有机层。洗涤中可能有些许乙醇残留，不过残留的乙醇应该不会影响到A230、A260、A280的比值吧...

残留乙醇会增加A230。
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6楼2013-09-10 05:54:03
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hymuanguing

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-10 05:54:03
残留乙醇会增加A230。...

A230峰值这么高是不是在沉淀RNA的时候，蛋白多糖也同RNA一起沉淀了？如果是这样，有什么解决的办法吗？
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7楼2013-09-11 23:14:44
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lbd218

银虫 (小有名气)
楼主问题解决了么？是怎么解决的？是不是RNA沉淀过程中，蛋白液同时沉淀了，干扰特别严重。我也遇到这问题了，方法肯定没问题，估计是提取过程中的某个环节出错
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8楼2013-09-13 11:34:44
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hymuanguing

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lbd218 at 2013-09-13 11:34:44
楼主问题解决了么？是怎么解决的？是不是RNA沉淀过程中，蛋白液同时沉淀了，干扰特别严重。我也遇到这问题了，方法肯定没问题，估计是提取过程中的某个环节出错

我的问题还没有解决呢个，论坛里还想也没有得到解决方法啊。我的组织中还有很多蛋白多糖而细胞含量相对较少。操作出错的可能性不大。正发愁呢，你也遇到我这样的问题了吗
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9楼2013-09-13 12:19:37
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lbd218

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hymuanguing at 2013-09-13 12:19:37
我的问题还没有解决呢个，论坛里还想也没有得到解决方法啊。我的组织中还有很多蛋白多糖而细胞含量相对较少。操作出错的可能性不大。正发愁呢，你也遇到我这样的问题了吗...

恩，一模一样的情况！230过高，可能是酚或者蛋白干扰，用移液管吸取上清的时候我吸得稍微多了点。吸上清不是不吸到有机相就可以的，如果需要的RNA不多的话，最好少吸一点。最近还没有细胞练手，如果有的话，重复一次实验可能就好了。
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10楼2013-09-14 12:36:48
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