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sherrysure

银虫 (小有名气)

[交流] 重组质粒转染后绿色荧光表达的很奇怪，附图，求大神解释~~感激不尽

重组质粒转染后绿色荧光表达的很奇怪，
和文献与别人做的差别很大，
我的荧光图都看不懂细胞形态，就是稀稀拉拉的云雾状，不知道是什么原因。
附图如下，求大神解释~~感激不尽
我用的载体是pEGFP-C2


重组质粒转染后绿色荧光表达的很奇怪，附图，求大神解释~~感激不尽
20倍-8y-bl-木虫求助.jpg


重组质粒转染后绿色荧光表达的很奇怪，附图，求大神解释~~感激不尽-1
40倍-10y-木虫求助.jpg
重组质粒转染后绿色荧光表达的很奇怪，附图，求大神解释~~感激不尽-2
20倍-9p-木虫求助-明场.jpg
重组质粒转染后绿色荧光表达的很奇怪，附图，求大神解释~~感激不尽-3
20倍-9y-木虫求助-明场对应.jpg
重组质粒转染后绿色荧光表达的很奇怪，附图，求大神解释~~感激不尽-4
空载对照.JPG



[ Last edited by sherrysure on 2013-9-5 at 14:52 ]
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1楼 2013-09-03 16:06:34
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hl16010921

木虫 (正式写手)
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-06 13:16:37
sherrysure: 金币+5, 谢谢！ 2013-09-06 16:28:10
1.文章里的图一般都是拍了几张甚至几十张里挑最佳视野的结果。而且一般都修过。你适当减低曝光时间，会更清晰些。2.转染过程对细胞膜是有损伤的，有时损伤很大。这导致细胞形态改变很正常。特别是瞬时转染24h后就观察的有时细胞还没恢复。细胞传个代要贴壁也得几个小时吧。所以转染遇到这情况很正常。如果表达几天内稳定，可以适当让细胞恢复一下（推测）3.膜蛋白的过表达可能影响细胞形态。毕竟膜表面的粘附可能会受到影响。4.空载体对照和你的基因的区别不明显。分不清细胞质和细胞膜表达。你把曝光时间调小，让光弱些，换40倍镜试试.调焦再细心些。照片荧光不要太亮了，导致周围都有些绿色了（空载体明显）。5.建议使用染料染细胞膜。这样能使结果更清晰准确。6.有条件的可以试试激光共聚焦显微镜，会清晰很多（调焦要耐心。）总之，转进去了，表达了，现在只是拍照和处理图片的问题，别太担心。很可能转入这个基因就是这样的。
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10楼2013-09-05 15:25:08
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
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你转染的是什么细胞？
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2楼2013-09-04 03:04:51
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-04 03:04:51
你转染的是什么细胞？

HEK293细胞（哺乳动物人），载体连的是是本来与禽类动物互作的基因，会有影响吗？
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3楼2013-09-04 08:42:41
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mamadexiao

木虫 (正式写手)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-04 21:12:06
一个问题，你的蛋白是怎么分布的？细胞内，还是包膜啊？
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4楼2013-09-04 09:59:32
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mamadexiao at 2013-09-04 09:59:32
一个问题，你的蛋白是怎么分布的？细胞内，还是包膜啊？

是跨膜蛋白，细胞膜上的吧
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5楼2013-09-04 11:39:11
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hl16010921

木虫 (正式写手)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-04 15:23:35
给张明场的图吧。要不然看不清。好像绿色的荧光不在一个聚焦平面上（膜蛋白的话很正常。），再调一下焦，明场的细胞轮廓清晰，关灯，开激发，看荧光。把明场的图和荧光叠加就好了。有激光共聚焦显微镜的话，可以试试，能清晰不少。
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6楼2013-09-04 11:48:43
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-04 11:48:43
给张明场的图吧。要不然看不清。好像绿色的荧光不在一个聚焦平面上（膜蛋白的话很正常。），再调一下焦，明场的细胞轮廓清晰，关灯，开激发，看荧光。把明场的图和荧光叠加就好了。有激光共聚焦显微镜的话，可以试试 ...

谢谢！！图片已更新~
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7楼2013-09-04 12:10:47
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hl16010921

木虫 (正式写手)
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-06 13:16:29
转染的细胞形态略有变化，好像有些变圆并突出，不像未转染的那么伸展。应该是正常现象。我合成了一下明场和荧光的图。从图上看转染效果还是不错的，你下次再微调一下焦距就更好了。另外调整一下对比和亮度，会更好些。
重组质粒转染后绿色荧光表达的很奇怪，附图，求大神解释~~感激不尽-5
123.jpg
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8楼2013-09-05 10:27:02
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-05 10:27:02
转染的细胞形态略有变化，好像有些变圆并突出，不像未转染的那么伸展。应该是正常现象。我合成了一下明场和荧光的图。从图上看转染效果还是不错的，你下次再微调一下焦距就更好了。另外调整一下对比和亮度，会更好些 ...

对的呢，我也很奇怪，发荧光的细胞基本上形态都不太好了。

我看文章里头的转染图片好像都没有我照的这样弥散状的呢，我又发了一张空质粒转染的图片，一般我看到的其他基因真核表达图片都是这样的。

是我的基因的问题吗？是入侵禽类的基因转染哺乳动物细胞的原因吗？
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9楼2013-09-05 14:53:09
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-05 15:25:08
1.文章里的图一般都是拍了几张甚至几十张里挑最佳视野的结果。而且一般都修过。你适当减低曝光时间，会更清晰些。2.转染过程对细胞膜是有损伤的，有时损伤很大。这导致细胞形态改变很正常。特别是瞬时转染24h后就观 ...

好的，谢谢你！那我摸索一下稳定转染，看看能不能拍出比较好的图片~
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11楼2013-09-06 16:28:00
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ronghua2013

新虫 (初入文坛)
★
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我也用含GFP的重组质粒转染了HEK293细胞，奇怪的是，转染了重组质粒的细胞在荧光显微镜下可见90%左右的绿色荧光，而转空载体的却难以看见GFP荧光，偶然找到三五个荧光细胞，这是怎么回事？求大神指点，不甚感激。
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12楼2014-10-18 20:35:54
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MarchZR

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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11楼: Originally posted by sherrysure at 2013-09-06 16:28:00
好的，谢谢你！那我摸索一下稳定转染，看看能不能拍出比较好的图片~...

稳转不比瞬转复杂吗，操作
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13楼2015-10-15 16:51:00
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