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[求助]
求助--肝微粒体孵育实验
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各位虫友，大家好，我最近在做肝微粒体孵育实验 但是没有反应， 我的反应体系是：肝微粒体 + 药 + NADPH + Mgcl2 + 缓冲液 → 共1ml ， 先将 肝微粒体 + 药 + Mgcl2 + 缓冲液37℃预孵育5min，NADPH 37℃预孵育5min 然后加到一块，于5、10、20、30、60、90、120min取100ul加100ul冰冷的甲醇溶液并放入-20℃冰箱中终止反应。 肝微粒体是直接买的，终浓度为1mg/ml。 NADPH四钠盐买的是罗氏的，用水配后分装小瓶，-80度冷冻，随用随拿，反应终浓度1mmol /L 。药物先取了个中间值试试，是600 umol/L，还有一个终浓度5mmol/L的Mgcl2。肝微粒体和NADPH应该都没有什么问题啊 但是却没什么反应 这是怎么回事呢 难道不该用NADPH或者是用水配不行？还是很说我的浓度有问题呢，我的缓冲液是ph7.4的磷酸钾缓冲液， 望各位虫友不吝赐教！金币奉送！ [ Last edited by 1949stone on 2013-8-27 at 07:55 ] |
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 分子生化实验经验积累 |
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gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 17:15:11
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 17:15:11
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额，对的我觉得底物终浓度600μmol/L是有点太高了，因为有的药物在浓度太高时同时也会是参与其反应酶的抑制剂的，建议你降低浓度，一般在不好确定底物浓度时1μM不失为一个好的选择。 还有一个关键的问题，你的底物是用什么溶剂配的，如果是有机溶剂的话，一定注意有机溶剂在你孵育体系中的总体积不超过孵育体积的1%，也就是说你1ml的孵育体系，底物顶多加到10μl NADPH一般终浓度1mM足够了， 灵敏度的话如果在液相上可以看到，质谱上应该灵敏度是不存在问题的 ~你是没有代谢产物标准品的吗，那你要怎么确定代谢产物的MS条件呢，是直接找多余的离子碎片？ 希望问题解决了可以告诉我一声~ |
4楼2013-08-27 10:03:35
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 22:04:56
whyxmc: 金币+200, ★★★很有帮助, 50 2013-08-27 06:51:02
1949stone: 楼上很满意您的回答 收了人家200金 您可要帮忙帮到底啊 2013-08-27 07:54:52
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1949stone: 楼上很满意您的回答 收了人家200金 您可要帮忙帮到底啊 2013-08-27 07:54:52
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要做肝微粒体实验，首先需要搞清楚该药物是经由何种酶代谢的，是I相反应的CYP酶或羧酸酯酶 ，还是说II相反应的结合酶UGT酶，因为肝微粒体中主要是I相的CYP酶和羧酸酯酶和II相的UGT酶，像其他II相酶如GST等在肝微粒体中是没有的。 确定了参与药物代谢酶后才能考虑你要采用的酶源使用microsome，cytosol或是S9 药物没被代谢原因很多，你用的是底物消除还是代谢产物生成，产物生成的话是不是因为你所用的仪器灵敏度未达到所致，可以采用高灵敏度的检测仪器，如LC-MS/MS等，底物消除的话会不会是因为底物消除的太少，此时可以适当提高酶浓度试一下。 还有你底物的终浓度是600μmol/L吗？有可能是该底物浓度过高，将参与其代谢的酶的活性抑制掉了 NADPH一般是现配现用，每次称粉末，一般是用你的缓冲盐溶液溶解，不建议直接配好分装，因为冻融对其活性也会有影响~ 综上，还主要是从你的检测灵敏度，药物底物浓度，NADPH配制入手，逐个排除，希望你实验早日有结果~ |
2楼2013-08-26 19:35:00
3楼2013-08-27 06:57:35
5楼2013-08-27 14:38:48
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