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[求助]
求助--肝微粒体孵育实验
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各位虫友，大家好，我最近在做肝微粒体孵育实验 但是没有反应， 我的反应体系是：肝微粒体 + 药 + NADPH + Mgcl2 + 缓冲液 → 共1ml ， 先将 肝微粒体 + 药 + Mgcl2 + 缓冲液37℃预孵育5min，NADPH 37℃预孵育5min 然后加到一块，于5、10、20、30、60、90、120min取100ul加100ul冰冷的甲醇溶液并放入-20℃冰箱中终止反应。 肝微粒体是直接买的，终浓度为1mg/ml。 NADPH四钠盐买的是罗氏的，用水配后分装小瓶，-80度冷冻，随用随拿，反应终浓度1mmol /L 。药物先取了个中间值试试，是600 umol/L，还有一个终浓度5mmol/L的Mgcl2。肝微粒体和NADPH应该都没有什么问题啊 但是却没什么反应 这是怎么回事呢 难道不该用NADPH或者是用水配不行？还是很说我的浓度有问题呢，我的缓冲液是ph7.4的磷酸钾缓冲液， 望各位虫友不吝赐教！金币奉送！ [ Last edited by 1949stone on 2013-8-27 at 07:55 ] |
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 分子生化实验经验积累 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 22:04:56
whyxmc: 金币+200, ★★★很有帮助, 50 2013-08-27 06:51:02
1949stone: 楼上很满意您的回答 收了人家200金 您可要帮忙帮到底啊 2013-08-27 07:54:52
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 22:04:56
whyxmc: 金币+200, ★★★很有帮助, 50 2013-08-27 06:51:02
1949stone: 楼上很满意您的回答 收了人家200金 您可要帮忙帮到底啊 2013-08-27 07:54:52
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要做肝微粒体实验，首先需要搞清楚该药物是经由何种酶代谢的，是I相反应的CYP酶或羧酸酯酶 ，还是说II相反应的结合酶UGT酶，因为肝微粒体中主要是I相的CYP酶和羧酸酯酶和II相的UGT酶，像其他II相酶如GST等在肝微粒体中是没有的。 确定了参与药物代谢酶后才能考虑你要采用的酶源使用microsome，cytosol或是S9 药物没被代谢原因很多，你用的是底物消除还是代谢产物生成，产物生成的话是不是因为你所用的仪器灵敏度未达到所致，可以采用高灵敏度的检测仪器，如LC-MS/MS等，底物消除的话会不会是因为底物消除的太少，此时可以适当提高酶浓度试一下。 还有你底物的终浓度是600μmol/L吗？有可能是该底物浓度过高，将参与其代谢的酶的活性抑制掉了 NADPH一般是现配现用，每次称粉末，一般是用你的缓冲盐溶液溶解，不建议直接配好分装，因为冻融对其活性也会有影响~ 综上，还主要是从你的检测灵敏度，药物底物浓度，NADPH配制入手，逐个排除，希望你实验早日有结果~ |
2楼2013-08-26 19:35:00
whyxmc: 回帖置顶 2013-08-28 07:10:12
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以下是我最终配置，希望您能看一下有哪里不对需要改正的，小妹初学，实属菜鸟啊，忘提出宝贵意见： 1） 0.1mol/L 磷酸钾缓冲溶液（PH 7.4） 配置：1mol/L的K2HPO4 取17.418 mg双蒸水定容至100ml 取80.2ml 1mol/L的KH2PO4 取13.609 mg双蒸水定容至100ml 取19.8ml 二者混合后用双蒸水稀释至1000ml，调ph至7.4。 即为0.1mol/L的磷酸钾缓冲溶液 2） 1mg/ml大鼠肝微粒体 原装：10mg/ml 即1mg/100ul 收到分装后立即将其放入到-80℃冰箱中，随用随拿，每次100ul 肝微粒体的复溶：放入4℃解冻，解冻后混合均匀即可，使用前保持低温储存。 3） 1mmol /L NADPH 原粉末25mg 分子量是833.4 用磷酸钾缓冲液配 1mmol /L = 0.8334 mg/ ml，所以将0.8334ⅹ5=4.167mg加入1ml磷酸钾缓冲液中，取200ul 即每200ul含0.8334mg，最后再使反应体系体积为1ml，即是（终浓度为1mmol /L NADPH） 4） 5mmol/L Mgcl2 5mmol/L = 20.3mg定容至100ml ，即2.03mg定容至1ml 取100ul 5） 5umol/L – 500umol/L 底物 用PH 7.4磷酸钾缓冲液配置 500 umol/L = 51.2 mg/L = 5.12mg/ml 即5.12mg定容1ml中取100ul 100 umol/L = 10.24 mg/L = 1.024mg/ml 取500 umol/L的底物100ul 稀释到500ul 50 umol/L = 5.12mg/L 取500 umol/L的底物 10ul 稀释到100ul 5 umol/L = 0.512 mg/L = 5.12mg/100ml 取50 umol/L的底物20ul 稀释到200ul 孵育体系为1ml →加入100ul的肝微粒体（终浓度为1mg/ml） →加入200ul 5 umol/L p-II （终浓度为5 umol/L） 加入100ul 50 umol/L p-II （终浓度为50umol/L） 加入500ul 100 umol/L p-II （终浓度为100 umol/L） 加入100ul 500 umol/L p-II （终浓度为500 umol/L） →加入200ul的NADPH (终浓度为1mmol /L) →加入100ul的Mgcl2 (终浓度为5mmol/L) 依据底物浓度共分四组，最后每组都用磷酸钾缓冲液补齐到1ml |
9楼2013-08-27 21:39:49
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以下是我最终配置，希望您能看一下有哪里不对需要改正的，小妹初学，实属菜鸟啊，忘提出宝贵意见： 1） 0.1mol/L 磷酸钾缓冲溶液（PH 7.4） 配置：1mol/L的K2HPO4 取17.418 mg双蒸水定容至100ml 取80.2ml 1mol/L的KH2PO4 取13.609 mg双蒸水定容至100ml 取19.8ml 二者混合后用双蒸水稀释至1000ml，调ph至7.4。 即为0.1mol/L的磷酸钾缓冲溶液 2） 1mg/ml大鼠肝微粒体 原装：10mg/ml 即1mg/100ul 收到分装后立即将其放入到-80℃冰箱中，随用随拿，每次100ul 肝微粒体的复溶：放入4℃解冻，解冻后混合均匀即可，使用前保持低温储存。 3） 1mmol /L NADPH 原粉末25mg 分子量是833.4 用磷酸钾缓冲液配 1mmol /L = 0.8334 mg/ ml，所以将0.8334ⅹ5=4.167mg加入1ml磷酸钾缓冲液中，取200ul 即每200ul含0.8334mg，最后再使反应体系体积为1ml，即是（终浓度为1mmol /L NADPH） 4） 5mmol/L Mgcl2 5mmol/L = 20.3mg定容至100ml ，即2.03mg定容至1ml 取100ul 5） 5umol/L – 500umol/L 底物 用PH 7.4磷酸钾缓冲液配置 500 umol/L = 51.2 mg/L = 5.12mg/ml 即5.12mg定容1ml中取100ul 100 umol/L = 10.24 mg/L = 1.024mg/ml 取500 umol/L的底物100ul 稀释到500ul 50 umol/L = 5.12mg/L 取500 umol/L的底物 10ul 稀释到100ul 5 umol/L = 0.512 mg/L = 5.12mg/100ml 取50 umol/L的底物20ul 稀释到200ul 孵育体系为1ml →加入100ul的肝微粒体（终浓度为1mg/ml） →加入200ul 5 umol/L p-II （终浓度为5 umol/L） 加入100ul 50 umol/L p-II （终浓度为50umol/L） 加入500ul 100 umol/L p-II （终浓度为100 umol/L） 加入100ul 500 umol/L p-II （终浓度为500 umol/L） →加入200ul的NADPH (终浓度为1mmol /L) →加入100ul的Mgcl2 (终浓度为5mmol/L) 依据底物浓度共分四组，最后每组都用磷酸钾缓冲液补齐到1ml |
10楼2013-08-29 15:24:40
3楼2013-08-27 06:57:35
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gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 17:15:11
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 17:15:11
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额，对的我觉得底物终浓度600μmol/L是有点太高了，因为有的药物在浓度太高时同时也会是参与其反应酶的抑制剂的，建议你降低浓度，一般在不好确定底物浓度时1μM不失为一个好的选择。 还有一个关键的问题，你的底物是用什么溶剂配的，如果是有机溶剂的话，一定注意有机溶剂在你孵育体系中的总体积不超过孵育体积的1%，也就是说你1ml的孵育体系，底物顶多加到10μl NADPH一般终浓度1mM足够了， 灵敏度的话如果在液相上可以看到，质谱上应该灵敏度是不存在问题的 ~你是没有代谢产物标准品的吗，那你要怎么确定代谢产物的MS条件呢，是直接找多余的离子碎片？ 希望问题解决了可以告诉我一声~ |
4楼2013-08-27 10:03:35
5楼2013-08-27 14:38:48
6楼2013-08-27 16:18:07
7楼2013-08-27 18:22:02
8楼2013-08-27 20:59:59
