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whyxmc

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助--肝微粒体孵育实验

各位虫友，大家好，我最近在做肝微粒体孵育实验 但是没有反应，
我的反应体系是：肝微粒体 + 药 + NADPH + Mgcl2 + 缓冲液 → 共1ml ，
先将 肝微粒体 + 药 + Mgcl2 + 缓冲液37℃预孵育5min，NADPH 37℃预孵育5min  然后加到一块，于5、10、20、30、60、90、120min取100ul加100ul冰冷的甲醇溶液并放入-20℃冰箱中终止反应。
肝微粒体是直接买的，终浓度为1mg/ml。 NADPH四钠盐买的是罗氏的，用水配后分装小瓶，-80度冷冻，随用随拿，反应终浓度1mmol /L  。药物先取了个中间值试试，是600 umol/L，还有一个终浓度5mmol/L的Mgcl2。肝微粒体和NADPH应该都没有什么问题啊 但是却没什么反应 这是怎么回事呢 难道不该用NADPH或者是用水配不行？还是很说我的浓度有问题呢，我的缓冲液是ph7.4的磷酸钾缓冲液， 望各位虫友不吝赐教！金币奉送！

[ Last edited by 1949stone on 2013-8-27 at 07:55 ]
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1楼 2013-08-26 15:56:34
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whyxmc

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yhang at 2013-08-27 16:18:07
恩，好的，我最长要孵育2h NADPH都还有活性的，半个小时如果酶活性好的话也足够代谢了~你还可以像你之前做的那样每隔一定时间取样，这样有一个时间依赖性，更能说明问题~...

这位虫友，还想请教一下你用的是NADPH四钠盐么？您说您是现用现配的，但是这样为了准确性免不了要多称量一些，可是NADPH只有25mg，怕不够呢？那怎样配才好呢？谢谢了！
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7楼2013-08-27 18:22:02
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yhang

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 22:04:56
whyxmc: 金币+200, ★★★很有帮助, 50 2013-08-27 06:51:02
1949stone: 楼上很满意您的回答 收了人家200金 您可要帮忙帮到底啊 2013-08-27 07:54:52
要做肝微粒体实验，首先需要搞清楚该药物是经由何种酶代谢的，是I相反应的CYP酶或羧酸酯酶
，还是说II相反应的结合酶UGT酶，因为肝微粒体中主要是I相的CYP酶和羧酸酯酶和II相的UGT酶，像其他II相酶如GST等在肝微粒体中是没有的。
确定了参与药物代谢酶后才能考虑你要采用的酶源使用microsome，cytosol或是S9
药物没被代谢原因很多，你用的是底物消除还是代谢产物生成，产物生成的话是不是因为你所用的仪器灵敏度未达到所致，可以采用高灵敏度的检测仪器，如LC-MS/MS等，底物消除的话会不会是因为底物消除的太少，此时可以适当提高酶浓度试一下。
还有你底物的终浓度是600μmol/L吗？有可能是该底物浓度过高，将参与其代谢的酶的活性抑制掉了
NADPH一般是现配现用，每次称粉末，一般是用你的缓冲盐溶液溶解，不建议直接配好分装，因为冻融对其活性也会有影响~
综上，还主要是从你的检测灵敏度，药物底物浓度，NADPH配制入手，逐个排除，希望你实验早日有结果~
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2楼2013-08-26 19:35:00
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whyxmc

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhang at 2013-08-26 19:35:00
要做肝微粒体实验，首先需要搞清楚该药物是经由何种酶代谢的，是I相反应的CYP酶或羧酸酯酶
，还是说II相反应的结合酶UGT酶，因为肝微粒体中主要是I相的CYP酶和羧酸酯酶和II相的UGT酶，像其他II相酶如GST等在肝微粒 ...

感谢您的帮忙，收益良多，那么我底物浓度的终浓度是600umol，您的意思是有点大是么？那么NADPH的浓度可以么？我的检测手段是LC/MS。灵敏度这是不是可以排除？之前有人做过这个药的肝微粒体，从液相上看产生的了代谢反应，但是那个时候没有液质，所以没有检测出代谢产物的结构，我的目的就是检测代谢产物的结构！
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3楼2013-08-27 06:57:35
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yhang

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 17:15:11
引用回帖:
3楼: Originally posted by whyxmc at 2013-08-27 06:57:35
感谢您的帮忙，收益良多，那么我底物浓度的终浓度是600umol，您的意思是有点大是么？那么NADPH的浓度可以么？我的检测手段是LC/MS。灵敏度这是不是可以排除？之前有人做过这个药的肝微粒体，从液相上看产生的了代谢 ...

额，对的我觉得底物终浓度600μmol/L是有点太高了，因为有的药物在浓度太高时同时也会是参与其反应酶的抑制剂的，建议你降低浓度，一般在不好确定底物浓度时1μM不失为一个好的选择。
还有一个关键的问题，你的底物是用什么溶剂配的，如果是有机溶剂的话，一定注意有机溶剂在你孵育体系中的总体积不超过孵育体积的1%，也就是说你1ml的孵育体系，底物顶多加到10μl
NADPH一般终浓度1mM足够了，
灵敏度的话如果在液相上可以看到，质谱上应该灵敏度是不存在问题的
~你是没有代谢产物标准品的吗，那你要怎么确定代谢产物的MS条件呢，是直接找多余的离子碎片？
希望问题解决了可以告诉我一声~
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4楼2013-08-27 10:03:35
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