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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Western目的条带处完全无信号（连背景都没），什么情况？
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

[求助] Western目的条带处完全无信号（连背景都没），什么情况？

如图，我的western结果中，目的条带的位置反而白花花一片，这是什么情况？左右两边理论上信号应该弱得多，反而有条带。由于抗体的原因，背景比较大，但空白应该与之无关。
求各位大神帮我。菜鸟谢过~

考染结果：


[ Last edited by pursuream on 2013-8-21 at 22:24 ]
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1楼 2013-08-21 22:03:31
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
pursuream: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-08-30 10:05:36
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-30 13:40:39
引用回帖:
3楼: Originally posted by pursuream at 2013-08-28 21:00:19
非常感谢您提醒~
怨不得我这帖子没人回复。。
实验已经做成了，把上样量和抗体浓度都减半，就正常曝光了。信号很强，十几秒就有过曝。
我猜测可能的原因是局部HRP密度太高，底物消耗尽了。（最开始做时没有在加 ...

从发光显影的图片看，两个空心的应该是条带亮度太强，发光液消耗没了，这样的样品最好加完发光液立刻显影，或使用差点的发光液。
背景不干净一般两个原因较大，一是抗体问题，二是蛋白有降解，估计你的第二种可能性较大，因为有拖尾。
望实验顺利！
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一直向前！
4楼2013-08-28 23:21:31
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangxn2010 at 2013-08-28 13:10:08
图片不显示额~~

非常感谢您提醒~
怨不得我这帖子没人回复。。
实验已经做成了，把上样量和抗体浓度都减半，就正常曝光了。信号很强，十几秒就有过曝。
我猜测可能的原因是局部HRP密度太高，底物消耗尽了。（最开始做时没有在加显影液之后显影。

虽然做出来了，还是来修一下我的失败之作~
Western目的条带处完全无信号（连背景都没），什么情况？
QQ截图20130828205754.jpg


Western目的条带处完全无信号（连背景都没），什么情况？-1
QQ截图20130828210003.jpg
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3楼2013-08-28 21:00:19
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangxn2010 at 2013-08-28 23:21:31
从发光显影的图片看，两个空心的应该是条带亮度太强，发光液消耗没了，这样的样品最好加完发光液立刻显影，或使用差点的发光液。
背景不干净一般两个原因较大，一是抗体问题，二是蛋白有降解，估计你的第二种可能 ...

谢谢您的回复~
确实应该是抗体浓度太大的缘故，我把抗体和上样量减半，并且加完发光液立刻显影，就正常了。
至于背景，抗体的的问题大些，这是室温两小时孵育的，改为4℃过夜效果就好得多。还有就是之前做的是蛋白上接biotin的反应，抗体也是biotin响应的，所以可能有部分生物素混在样品中，第二次做的时候切掉了下面的部分。至于降解，应该是有的，两条带是讲解产生的吧？
再show一下改善的图
Western目的条带处完全无信号（连背景都没），什么情况？-2
QQ截图20130830101235.jpg
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5楼2013-08-30 10:22:52
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