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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

[求助] Western目的条带处完全无信号(连背景都没),什么情况?

如图,我的western结果中,目的条带的位置反而白花花一片,这是什么情况?左右两边理论上信号应该弱得多,反而有条带。由于抗体的原因,背景比较大,但空白应该与之无关。
求各位大神帮我。菜鸟谢过~

考染结果:


[ Last edited by pursuream on 2013-8-21 at 22:24 ]
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

图片不显示额~~
一直向前!
2楼2013-08-28 13:10:08
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangxn2010 at 2013-08-28 13:10:08
图片不显示额~~

非常感谢您提醒~
怨不得我这帖子没人回复。。
实验已经做成了,把上样量和抗体浓度都减半,就正常曝光了。信号很强,十几秒就有过曝。
我猜测可能的原因是局部HRP密度太高,底物消耗尽了。(最开始做时没有在加显影液之后显影。

虽然做出来了,还是来修一下我的失败之作~
Western目的条带处完全无信号(连背景都没),什么情况?
QQ截图20130828205754.jpg


Western目的条带处完全无信号(连背景都没),什么情况?-1
QQ截图20130828210003.jpg

3楼2013-08-28 21:00:19
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
pursuream: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-08-30 10:05:36
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-30 13:40:39
引用回帖:
3楼: Originally posted by pursuream at 2013-08-28 21:00:19
非常感谢您提醒~
怨不得我这帖子没人回复。。
实验已经做成了,把上样量和抗体浓度都减半,就正常曝光了。信号很强,十几秒就有过曝。
我猜测可能的原因是局部HRP密度太高,底物消耗尽了。(最开始做时没有在加 ...

从发光显影的图片看,两个空心的应该是条带亮度太强,发光液消耗没了,这样的样品最好加完发光液立刻显影,或使用差点的发光液。
背景不干净一般两个原因较大,一是抗体问题,二是蛋白有降解,估计你的第二种可能性较大,因为有拖尾。
望实验顺利!
一直向前!
4楼2013-08-28 23:21:31
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangxn2010 at 2013-08-28 23:21:31
从发光显影的图片看,两个空心的应该是条带亮度太强,发光液消耗没了,这样的样品最好加完发光液立刻显影,或使用差点的发光液。
背景不干净一般两个原因较大,一是抗体问题,二是蛋白有降解,估计你的第二种可能 ...

谢谢您的回复~
确实应该是抗体浓度太大的缘故,我把抗体和上样量减半,并且加完发光液立刻显影,就正常了。
至于背景,抗体的的问题大些,这是室温两小时孵育的,改为4℃过夜效果就好得多。还有就是之前做的是蛋白上接biotin的反应,抗体也是biotin响应的,所以可能有部分生物素混在样品中,第二次做的时候切掉了下面的部分。至于降解,应该是有的,两条带是讲解产生的吧?
再show一下改善的图
Western目的条带处完全无信号(连背景都没),什么情况?-2
QQ截图20130830101235.jpg

5楼2013-08-30 10:22:52
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