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暖暖暖铁虫 (小有名气)
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[求助]
扩全基因时翻转录用什么引物啊？？？？？求大虾~~！
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| 我比对了我要扩的基因的全序列 ，发现5‘和3’都是保守的，全基因不长就2000bp，于是我就在两端最顶端设计了一对引物，请问我反转录时候用什么引物才能得到全长呢？随机引物是不是末端的序列不一定能反转录完全？？一步方法RT-PCR能解决问题吗？求大神解救，我是新手~~ |
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2楼2013-08-10 15:41:27
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【答案】应助回帖
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反转录引物有随机引物、Oligo(dT)、基因特异性引物（GSP）三种。 使用oligo dT引物扩增的产物, 可以保证扩增产物包括mRNA的3'末端(减少rRNA的干扰), 但是oligo dT primer扩增有一个问题, 就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的问题, 之所以有长度这个问题,一方面和lz所提到的RNA完整性有关,但最重要的限制在于逆转录酶的延伸能力. 用oligo dT primer扩增可能出现扩增出来的片段长度短, 虽然都有mRNA的3'端, 但是序列信息多位于3'-UTR附近, 若扩增序列太短,则有用信息很少, 不利于序列的识别和分析. 使用random primer, 也有片段长度的限制, 但是由于它的逆转录并不一定在mRNA的末端起始, 而是在随机位置起始,所以它的扩增片段带有更多CDS的信息.但是如果是用总RNA逆转录的话,有可能会受到rRNA的干扰. 至于Gsp,只是在扩增已知gene/gene family以及部分原理的RACE中使用. |
3楼2013-08-10 15:57:35
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4楼2013-08-10 18:09:07
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