24小时热门版块排行榜

南方科技大学公共卫生及应急管理学院2026级博士研究生招生报考通知（长期有效）

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

怡红痴子

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1548.6
散金: 400
红花: 2
帖子: 72
在线: 72.5小时
虫号: 2515219
注册: 2013-06-20
性别: GG
专业: 环境微生物学

[求助] TA克隆，假阳性？假阴性？已有1人参与

楼主初学TA克隆，经过一翻坎坷之后，终于小有成果，但是最近遇到了一个新的问题。
我是做土壤细菌氨氧化基因的TA克隆，目的片段大概490bp，用的载体试剂盒是TAKARA的pMD18-T，将PCR产物16℃过夜连接后，转入80uL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，LB液体37℃，200rpm摇1h后，离心浓缩至150uL菌液涂板（含100ug/mL氨苄），然后倒置37℃过夜培养（大约12h）。次日共挑取了78个单菌落分别接种到1mL氨苄LB液体培养基中37℃、200rpm培养12h，取1uL菌液进行PCR（采用M13-47和RV-M这对载体通用引物），但是菌液PCR验证结果只有29个阳性克隆，其中有一个还混入了空载体算是废掉了，只剩28个，可是78个只有28个是阳性，这比率也太小了点吧？
其他那49个没P出来的到底是氨苄筛选时的假阳性呢？还是菌液PCR时的假阴性？是不是我哪里没做好，请高人帮我分析一下原因，不胜感激！

PS：我同时做了阳性和阴性对照的，都很正常，阳性随机挑了9个菌落做PCR，验证结果都是阳性的

[ Last edited by 怡红痴子 on 2013-8-7 at 21:29 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种? 已经有5人回复
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》已经有3人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有133人回复
求助食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社电子版已经有5人回复
胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

1楼2013-08-07 21:11:32

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

怡红痴子

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1548.6
散金: 400
红花: 2
帖子: 72
在线: 72.5小时
虫号: 2515219
注册: 2013-06-20
性别: GG
专业: 环境微生物学

引用回帖:

14楼: Originally posted by swach at 2014-07-09 11:00:20
谢谢你，不过可不可以请你把Brown的文章题目给我一下呢？只有作者名字我不好检索，谢谢。...

Brown M.N., Briones A., Diana J., Raskin L. 2013. Ammonia-oxidizing archaea and nitrite-oxidizing nitrospiras in the biofilter of a shrimp recirculating aquaculture system. FEMS Microbiol Ecol 83: 17-25.