应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆，假阳性？假阴性？
52/1返回列表
查看: 2948  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

怡红痴子

金虫 (小有名气)

[求助] TA克隆，假阳性？假阴性？ 已有1人参与

楼主初学TA克隆，经过一翻坎坷之后，终于小有成果，但是最近遇到了一个新的问题。
我是做土壤细菌氨氧化基因的TA克隆，目的片段大概490bp，用的载体试剂盒是TAKARA的pMD18-T，将PCR产物16℃过夜连接后，转入80uL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，LB液体37℃，200rpm摇1h后，离心浓缩至150uL菌液涂板（含100ug/mL氨苄），然后倒置37℃过夜培养（大约12h）。次日共挑取了78个单菌落分别接种到1mL氨苄LB液体培养基中37℃、200rpm培养12h，取1uL菌液进行PCR（采用M13-47和RV-M这对载体通用引物），但是菌液PCR验证结果只有29个阳性克隆，其中有一个还混入了空载体算是废掉了，只剩28个，可是78个只有28个是阳性，这比率也太小了点吧？
其他那49个没P出来的到底是氨苄筛选时的假阳性呢？还是菌液PCR时的假阴性？是不是我哪里没做好，请高人帮我分析一下原因，不胜感激！

PS：我同时做了阳性和阴性对照的，都很正常，阳性随机挑了9个菌落做PCR，验证结果都是阳性的

[ Last edited by 怡红痴子 on 2013-8-7 at 21:29 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2013-08-07 21:11:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 怡红痴子 at 2014-07-08 19:34:23
The PCR amplification of bacterial amoA gene fragments were performed using the primer pair amoA-1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′) and amoA-2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′) (Rotthauwe et al. 1997) u ...

谢谢你，不过可不可以请你把Brown的文章题目给我一下呢？只有作者名字我不好检索，谢谢。
赞一下 回复此楼
14楼2014-07-09 11:00:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答

cookee1981

银虫 (初入文坛)
怎么没有看到你在转化时的冰浴和热激这两步？
赞一下 回复此楼
2楼2013-08-08 10:49:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

怡红痴子

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cookee1981 at 2013-08-08 10:49:23
怎么没有看到你在转化时的冰浴和热激这两步？

这两步当然做了的，只是在贴子里省略没写
赞一下 回复此楼
3楼2013-08-08 11:00:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 13:54:09
空载体也有氨苄抗性，所以抗性克隆不一定有insert，因此才要筛选。一般也不用筛那么多，用菌落PCR做十几个二十个就足够，把PCR阳性的克隆摇菌再提质粒做完整鉴定（通常还需要测序）后可以进行下一步克隆。一般做克隆阳性克隆的比例在50%以上，如果比例不是太低都是可以接受的。
赞一下 回复此楼
4楼2013-08-08 11:35:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 化学调剂0703 +7 啊我我的 2026-03-11 7/350 2026-03-15 23:03 by 凌千颂111
[考研] 0703化学调剂 ，六级已过，有科研经历 +4 曦熙兮 2026-03-15 4/200 2026-03-15 18:01 by JourneyLucky
[考研] 一志愿哈工大材料324分求调剂 +5 闫旭东 2026-03-14 5/250 2026-03-14 14:53 by 木瓜膏
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +3 Losir 2026-03-12 3/150 2026-03-14 12:11 by 热情沙漠
[考研] 0703化学求调剂 +5 很老实人 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:57 by JourneyLucky
[考研] 327求调剂 +4 Ffff03 2026-03-10 4/200 2026-03-14 00:17 by JourneyLucky
[考研] 332求调剂 +3 zjy101327 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:48 by JourneyLucky
[考研] 求调剂（材料与化工327） +4 爱吃香菜啦 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:11 by JourneyLucky
[考研] 求材料调剂 +5 隔壁陈先生 2026-03-12 5/250 2026-03-13 22:03 by 星空星月
[考研] 285学硕求调剂 +6 柴郡猫_ 2026-03-12 6/300 2026-03-13 20:46 by hmn_wj
[考研] 26调剂/材料科学与工程/总分295/求收留 +9 2026调剂侠 2026-03-12 9/450 2026-03-13 20:46 by 18595523086
[考研] 材料与化工085600调剂求老师收留 +9 jiaanl 2026-03-11 9/450 2026-03-13 20:22 by JourneyLucky
[考研] 【0856】化学工程（085602）313 分，本科学科评估A类院校化学工程与工艺，诚求调剂 +7 小刘快快上岸 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:06 by ruiyingmiao
[考研] 考研调剂 +4 芬达46 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:04 by ruiyingmiao
[考研] 085600材料与化工 309分请求调剂 +7 dtdxzxx 2026-03-12 8/400 2026-03-13 14:43 by jxchenghu
[考研] 一志愿华中师范071000，325求调剂 +5 RuitingC 2026-03-12 5/250 2026-03-13 10:43 by hyswxzs
[考研] 296求调剂 +3 大口吃饭 身体健 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:31 by 学员8dgXkO
[考研] 420求调剂 +4 莫向外求11 2026-03-10 6/300 2026-03-12 14:41 by ruiyingmiao
[考研] 一志愿江南大学085701环境工程专硕总分287求调剂 +5 18266118446 2026-03-09 5/250 2026-03-11 16:51 by 2020015
[考研] 327分求调剂086 +4 西红柿?小帅 2026-03-09 7/350 2026-03-10 14:47 by ruiyingmiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭