24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 2202  |  回复: 20
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

放肆猫某人

铜虫 (小有名气)

[交流] 我有一个关于无菌操作的疑问!已有4人参与

这半个月一直在做提细菌DNA,顺便进行单菌落PCR的实验。
我觉得很奇怪的就是如果我在挑取单菌落至液体培养基内进行摇床培养,我怎么才能证明我操作过程中未染杂菌,每次培养在小管子里,直接观察起来差别好大,有的觉得整个液体浑浊度较为均匀,有的就是均匀,但是液体上面会有一层膜,还有的就是上面有一部分菌靠近液体上层,下面就还有部分菌沉淀,中间部分不怎么浑浊。总觉得是污染了醋酸杆菌。因为菌种为芽孢杆菌,试过进行芽孢染色镜检,效果却很不理想,都是杆菌,而且杆状有长有短,老师说在液体培养基的杆菌会有的长有的短,有的长的还可能是短的连一起了,而且只培养差不多15个小时左右,芽孢又不多,根本不能辨别是否染菌,如果染菌了,PCR的产物很可能有污染,拿去测序岂不就是杂菌的序列吗?测序又贵,老师又是那种特别节约的人,真怕浪费他钱,结果测出来还是个错的!等着挨骂啊!
而且现在老师让我跟另外一个老师专门学技术,可是那老师根本就不怎么教我啊,每次都让我自己做,不懂问跟他做实验的学生,自己慢慢摸索,出了结果再找他。结果出了结果找他,他让我自己寄去上海,一个礼拜之后他告诉我,温度太高没测出来,让我再做一次,我继续做了然后问他要不要用冰袋什么的,他却又说不用,那温度不还是会很高啊。现在正在等着第二次的结果,多说都是泪啊!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

swnz

木虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流! 2013-08-07 20:59:07
貌似你们条件比较差,没有一个熟手帮助,困难重重。是否污染应该容易判断的,这是做微生物操作的基本要求。一般通过镜检,油镜观察形态。很多时候要凭经验。
跟着感觉走
3楼2013-08-07 15:42:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

swnz

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 放肆猫某人 at 2013-08-09 18:41:58
就是凭的感觉啊 油镜下也感觉看不清  区分不了 就算菌体上没有芽孢 也不能判断究竟是否染菌 而且学校地方比较偏僻 要寄去上海测序 最近温度很高 DNA都降解了 都不知道怎么办 觉得白提了 放假这么久了都没回家的 每 ...

除了镜检外,你可以把培养物用接种环在YB平板上划线,尽量划出较多的单菌落。37度培养两天后鉴别菌落形态是否一致,不一致的话,就是污染。因为你可以先把12h左右的菌液取出离心,沉淀冻在冰箱里。如果觉得没有污染,再提基因组DNA不迟。测序公司在大的城市都有,没有必要一定选上海。DNA也可以干燥后寄出,稳定性好些。
跟着感觉走
12楼2013-08-09 21:29:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

swnz

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 放肆猫某人 at 2013-08-09 21:43:17
我送的是PCR的产物 也能干燥吗? 一定要在YB平板吗 牛肉膏蛋白胨不行吗~...

PCR产物如果没有杂带,就可以用乙醇加入乙酸钠沉淀回收,不需要用TE溶解,吹干后即可送出去测序(参见小木虫【求助/交流】200bpDNA片段回收效率低)。如果有杂带,就要用胶回收方法,用试剂盒回收DNA,然后用同上方法乙醇沉淀。注意,乙醇沉淀回收时加入乙酸钠(终浓度为0.3M),是为了促进沉淀。-20度放置一夜后,高速离心得到沉淀,用75%乙醇洗涤2次,再凉干。这个方法虽然我自己没有用过(都是以液态状态送出去),但是原理上是可行的,很多帖子上也都有。有兴趣的话可以试一试。至于平板培养基,不需要限定LB。
跟着感觉走
17楼2013-08-10 08:00:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

swnz

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by 放肆猫某人 at 2013-08-10 21:03:49
好专业的样子 我不会切胶啊 小小本科生 很多都不会 我的是1500bp左右的片段 不是说回收效率低吗 如果是沉淀的话 遇到天气炎热也没关系吗 非常谢谢你!!!...

产物够多的话,回收不成问题。沉淀的时候,要放在-20度。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

跟着感觉走
20楼2013-08-10 22:10:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 放肆猫某人 的主题更新
普通表情 高级回复(可上传附件)
信息提示
请填处理意见