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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助——基因亚克隆
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seersino

金虫 (小有名气)

[求助] 求助——基因亚克隆

本人需要把目的片段亚克隆到12000bp的载体中，酶切鉴定重组质粒时，目的片段正确但载体大小不对，大约5000bp。开始怀疑环境中污染，后来换了几个地方都是同样结果。想不出什么原因了。请各位高手帮忙。这个事困扰我很久了。谢谢

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-29 at 16:03 ]
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生物民工
1楼 2013-07-20 18:09:39
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 21:47:54
载体是怎么制备的, 酶切完成后割胶回收时有没有发现质粒大小异样?
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2楼2013-07-20 18:33:04
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changes

木虫 (正式写手)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 07:51:29
先鉴定载体有没有问题，可以利用酶切(选择多克隆位点和其上下游的其它的酶切位点)，或者根据载体序列设计引物对载体进行测序验证。

其次才能进行载体的构建，构建成功的克隆子最终也要进行测序验证。
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3楼2013-07-20 22:26:40
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
3楼说的对啊，先确定载体对不对啊
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4楼2013-07-21 20:58:26
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seersino

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-07-20 18:33:04
载体是怎么制备的, 酶切完成后割胶回收时有没有发现质粒大小异样?

载体怎么制的我不清楚 切胶回收跑电泳条带大小没问题
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生物民工
5楼2013-07-24 22:19:02
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seersino

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by changes at 2013-07-20 22:26:40
先鉴定载体有没有问题，可以利用酶切(选择多克隆位点和其上下游的其它的酶切位点)，或者根据载体序列设计引物对载体进行测序验证。

其次才能进行载体的构建，构建成功的克隆子最终也要进行测序验证。

载体是构建好的 我现在的问题就是亚克隆后 酶切验证大片段的位置不对 有哪个大神遇见过这种情况 我不知道是哪出的问题 该怎么解决
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生物民工
6楼2013-07-24 22:21:56
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seersino

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yb19841014 at 2013-07-21 20:58:26
3楼说的对啊，先确定载体对不对啊

载体是重改造的 消除了很多酶切位点 用NcoI HindIII 能切出12000bp左右的大片段 和GFP片段 没有杂带
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生物民工
7楼2013-07-24 22:24:37
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seersino

金虫 (小有名气)
别沉了啊
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生物民工
8楼2013-07-28 21:58:54
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seersino

金虫 (小有名气)
哪个高手遇到过这种情况 帮忙解决 可以加金币
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生物民工
9楼2013-07-28 21:59:35
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主可否拿去测序呢？
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keepon
10楼2013-07-29 08:58:39
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