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求助：荧光光谱在乙醇和水中差别极大
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我们测试一个荧光探针的荧光性质，发现它在乙醇中的荧光强度很高，0.5uM浓度时，激发波长450nm，最大发射波长为500nm，荧光强度为500多。 当该探针在以水作溶剂时，荧光光谱差别很大。5uM浓度时，500nm处的荧光强度只有150左右，而与此同时，激发光波长附近的荧光强度则>10000，超过了仪器的检测限。（这两个实验的仪器的参数基本相同，除了发射波长差了几个nm）  由于该探针在水中溶解性不好，我们配溶液的时候，是用少量DMSO助溶，然后加入到水中的，这样配制的5uM的探针水溶液未发现浑浊。但其荧光光谱中激发波长450nm处的荧光值增加那么多，而500nm处的荧光强度下降极大，到底是什么原因呢？请各位大侠指教~ 另附这两个溶液的紫外光谱。   |
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【答案】应助回帖
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(1)不同溶剂中，物质的荧光性质不同，是一件很正常的事情。因为物质溶于溶剂后就会溶剂化，我们得到的光谱其实并非是单纯该物质的光谱。求助者不提供荧光探针的结构，无法给出更为详细的回答。 (2)荧光光谱的测量上有点小问题。对于普通的荧光测量而言，激发波长小于发射波长，我们记录荧光发射光谱时，发射光谱的波长起始位置，一般比激发波长大10-20 nm。激发光波长附近的强峰，主要是样品（包括样品池）对激发光的散射造成的，难以反映样品本身的荧光特性。 (3)求助者的实验设计有点问题。要比较不同情况下的光谱，样品浓度应尽量一致，避免自吸收、分子间相互作用造成的影响。 |
2楼2013-07-15 23:13:02
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感谢应助，逐条回答。 （1）荧光探针结构，由于课题仍处于探索阶段，尚不能提供。但已知荧光探针疏水性较强，在较多的EtOH（3mg/10ml）中溶解性尚可，在水中溶解性则很差（2mg在50ml 水中不能溶）。因而采用了DMSO助溶，再加到水中稀释至5uM。尽管该浓度的溶液并未析出，但其荧光光谱在激发光波长附近的荧光强度较EtOH溶液中高得多，是否是因为探针水溶性差，在水中聚集成簇，所以散射光强度很高？是否可以做其它实验来验证该推测？如果用紫外检测，聚集成簇的胶束溶液和均匀分散的溶液在紫外吸收上是否都符合蓝波比尔定律？ （2）感谢指出测量的问题。下次测量时的确应该从比激发波长大10-20nm以上开始采集数据，这样还可以提高数据采集的速度。 （3）你提出的问题很对，的确应该是在只改变一个变量的条件下进行数据的比较。下图中有0.5uM探针水溶液的荧光光谱，可见其荧光强度更低。  我目前的问题是如何确证该荧光探针在水中荧光强度下降极大是其在水中分散不好所致（溶剂化所导致的荧光性质变化的确是一个解释，但不够让人信服）？如果是这样，下一步势必要想办法改善该探针的水溶性。 |
3楼2013-07-16 16:44:10
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是否是因为探针水溶性差，在水中聚集成簇，所以散射光强度很高？有可能 聚集成簇的胶束溶液和均匀分散的溶液在紫外吸收上是否都符合蓝波比尔定律？这个自然，但是摩尔吸光系数会不同。因为光吸收公式中，溶质被看作质点，胶束和游离分子是不同的质点 如何确证该荧光探针在水中荧光强度下降极大是其在水中分散不好所致？这个不太容易，估计要结合荧光寿命的检测来验证 |
4楼2013-07-16 19:19:03
5楼2013-07-16 22:00:33
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