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何超

金虫 (正式写手)

[交流] HPLC交流

本人在做液相的时候遇到了一个很奇怪的现象，现描述如下：
1，第一次做的时候，标准品在在线实时界面明明显示的是一个峰，在离线数据里查看的时候居然出现了两个连着的峰，不过前面那峰很小，分离度也还行，算是完全分开了，别人的解释是标准品不稳定很容易分解，但我在实时分析里面明明看到的是一个峰啊~~~~~~
2，第二次做同一个样品，用标准品做线性的时候，进样量大于10 ul 标准品峰就分裂成两个，但是是双峰骆驼的肩峰，没有分离度可言，两个峰面积的和也正好成比例；而样品里该物质的浓度是标准品的3倍左右，进样量同是10 ul （相当于标准品进样量30 ul），图谱显示一个峰，并没有分裂成两个峰。
3，标准品是咖啡酸，药典的方法，觉得方法应该是没有问题的，想问一下如果是柱子的问题会不会出现这种情况。
盼大家积极回复，小女子有礼啦~~~~~~
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1楼 2013-07-14 11:27:28
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wangkaibo123

荣誉版主 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
何超: 金币+2, 谢谢参与 2013-07-14 16:40:09
1  在线时一个峰 在解析两个 可能是在线时210波长 解析时254 波长不一样，峰行不一样，你核对下

2  样品浓时出现肩峰是很正常的 ，与柱子的承载能力有关 只要进样少时是一个峰就可以了 肯定是一个化合物
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3楼2013-07-14 13:55:14
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jwr

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
何超: 金币+1, 谢谢参与 2013-07-15 20:49:59
第一情况可以考虑工作站的标尺问题！
第二种情况应该是超载！
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13楼2013-07-15 08:28:15
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普通回帖

只要心够决

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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xiaoxiao270: 金币+2 2013-07-14 13:07:11
何超: 金币+2, 谢谢参与 2013-07-14 16:55:33
同一个样品应该不会是样品分解了  如果样品没问题的话  估计柱子扛不住了 LZ不妨换一根柱子试试
如果色谱柱坏了，反相柱，只要不是认为摔的缘故，坏的原因主要是柱头脏了。解决这个问题的方法：用30%异丙醇甲醇低流速冲洗过夜，冲洗完后用纯甲醇低流速顶替一天再上水相，PS： LZ还是换个柱子试试吧~
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2楼2013-07-14 13:02:43
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何超

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 只要心够决 at 2013-07-14 13:02:43
同一个样品应该不会是样品分解了  如果样品没问题的话  估计柱子扛不住了 LZ不妨换一根柱子试试
如果色谱柱坏了，反相柱，只要不是认为摔的缘故，坏的原因主要是柱头脏了。解决这个问题的方法：用30%异丙醇甲醇低流 ...

之前我也怀疑是柱子的载样量的问题，但是我用同一根柱子进了样品的，根据峰面积显示浓度是标准品的3倍，进样量也是10 ul ，样品显示也是一个峰，我直接用标准品进30 ul 还是双驼肩峰，都不知道怎么回事。
话又说回来，方法是药典的方法，应该是经过方法学考察的，线性范围应该也是比较宽的吧......
谢谢参与哦......
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4楼2013-07-14 16:23:00
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fuliu222

铁杆木虫 (著名写手)
明显是超载
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5楼2013-07-14 16:34:51
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何超

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangkaibo123 at 2013-07-14 13:55:14
1  在线时一个峰 在解析两个 可能是在线时210波长 解析时254 波长不一样，峰行不一样，你核对下

2  样品浓时出现肩峰是很正常的 ，与柱子的承载能力有关 只要进样少时是一个峰就可以了 肯定是一个化合物

我用的仪器配的检测器就是普通的Uis-UV，只有一个检测波长的，再解析的波长会跟在线不一样吗？我怎么看再解析的波长呢？从来都没关注过这个问题啊......还有，如果是波长不一样的缘故，也应该是出一个峰吧，毕竟只有一个化合物......
问题是样品的浓度更高也没有成两个峰，难道柱子会分离标准品的效果比样品差吗？
谢谢参与......
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6楼2013-07-14 16:38:48
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JinyHuang

木虫 (小有名气)
★ ★
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何超: 金币+1, 谢谢参与 2013-07-14 17:02:03
针对第一个问题，如果你那时候再走多一针估计样品也会像离线数据显示的那样，估计是第一针的时候整个色谱系统还没走好。
针对第二个问题，我可以很确定地告诉你超载了，我做过一个10-HDA的实验，样品都稀释到2500倍了进10μl还是会负载，估计跟你的色谱柱接头太细有关系，也跟机器的灵敏度有关系，减少进样量，用8μl深圳5μl试一试
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7楼2013-07-14 16:47:40
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何超

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by JinyHuang at 2013-07-14 16:47:40
针对第一个问题，如果你那时候再走多一针估计样品也会像离线数据显示的那样，估计是第一针的时候整个色谱系统还没走好。
针对第二个问题，我可以很确定地告诉你超载了，我做过一个10-HDA的实验，样品都稀释到2500倍 ...

第一个问题可能是我没说清楚，我走第二针标准品的时候在线也是一个峰，离线两个。但是用后面的大峰计算样品中该物质的含量与后面的只有一个峰的差不多......我就是觉得这种现象很诡异
对于第二个问题，我已经说了很多遍了，如果是过载，样品的峰没有分解啊......
我进10 ul 是没有问题的，超过10就不行了（试过相当于12.5ul的），我要做方法学验证，所以要进样量大一点的
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8楼2013-07-14 17:01:47
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何超

金虫 (正式写手)
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5楼: Originally posted by fuliu222 at 2013-07-14 16:34:51
明显是超载

如果是简单的超载的话，样品怎么解释呢？
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9楼2013-07-14 17:02:55
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kkbyb

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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何超: 金币+2, 谢谢参与 2013-07-14 23:55:25
大体积双峰是你使用的溶剂不合适，不是纯乙腈就纯甲醇吧，咖啡酸很稳定，不容易分解，标品有两峰就是标品不纯，中检所的标品也不是100%的。多说一句，线性没有用体积做的，要不同浓度
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10楼2013-07-14 21:40:26
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何超

金虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by kkbyb at 2013-07-14 21:40:26
大体积双峰是你使用的溶剂不合适，不是纯乙腈就纯甲醇吧，咖啡酸很稳定，不容易分解，标品有两峰就是标品不纯，中检所的标品也不是100%的。多说一句，线性没有用体积做的，要不同浓度

前面说了，药典的方法，你见过药典的方法里有纯乙腈纯甲醇的吗？我的是甲醇-磷酸盐缓冲液（23：77）
做线性只能用不同浓度吗？自动进样的一个母液设置不同进样体积的方法不行吗？如果是有规定，能否指教一下出自何处呢？对我很重要的，这以后可能就是我的工作了.......
盼大侠进一步指教......
谢谢参与......
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12楼2013-07-14 23:55:07
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JinyHuang

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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8楼: Originally posted by 何超 at 2013-07-14 17:01:47
第一个问题可能是我没说清楚，我走第二针标准品的时候在线也是一个峰，离线两个。但是用后面的大峰计算样品中该物质的含量与后面的只有一个峰的差不多......我就是觉得这种现象很诡异
对于第二个问题，我已经说了 ...

楼主我明白您的意思，我做过β胡萝卜素的实验，是超高效液相进样的，进3μl的时候呢，它的峰确实没裂解，但是给人的感觉就像包了东西一样，不对称，肩部那里鼓了起来，我不知道你的是不是这样一个情况……然后呢，第一个问题，如果是这样的话会不会本身这样的图谱就是合理现象？我做芦荟苷的时候对照品也是前面有个小峰，响应值相比于主峰很低很低。。
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14楼2013-07-15 15:34:32
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何超

金虫 (正式写手)
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13楼: Originally posted by jwr at 2013-07-15 08:28:15
第一情况可以考虑工作站的标尺问题！
第二种情况应该是超载！

工作站的标尺？我在线的时候就放大了很多的，比例再大也没分成两个峰......
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15楼2013-07-15 20:47:39
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novus

铁杆木虫 (著名写手)
★
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http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2972445

建议楼主看看本版的HPLC相关帖子汇总，里面有很多情况都是新手常见的问题哦。
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16楼2013-07-16 23:53:43
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zhgjsyzhyang

金虫 (小有名气)
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何超: 金币+5, 非常有用 2013-07-17 20:35:40
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12楼: Originally posted by 何超 at 2013-07-14 23:55:07
前面说了，药典的方法，你见过药典的方法里有纯乙腈纯甲醇的吗？我的是甲醇-磷酸盐缓冲液（23：77）
做线性只能用不同浓度吗？自动进样的一个母液设置不同进样体积的方法不行吗？如果是有规定，能否指教一下出自何 ...

第一个问题：可以看一下设置里面有没有信号放大之类的，普通紫外检测不会出现在线波长和离线波长不一致的情况，没碰到过在线和离线不一致的问题。至于主峰前面有一个小峰，其实这种情况挺常见的，可能是柱子脏，可能样品不纯；走空白看一下，不影响检测就行
第二个问题：用同一根柱子进了样品的，根据峰面积显示浓度是标准品的3倍，进样量也是10 ul ，样品显示也是一个峰，我直接用标准品进30 ul 还是双驼肩峰。
做线性没有明确规定只能用不同浓度，不能用不同体积的方法（我没查到），改进样量做线性是可行的，但是有一定缺陷，进样量越大，峰越宽，峰高越低，柱效低，一般还是一个峰（双头峰可能还是和柱子流动相有关），但是峰面积应该还是一样的。这也是做线性大都采用不同浓度，而不用不同体积的原因，虽然稀释不同浓度可能增加误差。含量线性要求80%-120%，进12ul应该没问题，30 ul就不好说了。这也是为什么药典要规定进样量，如果改变进样量应该重新验证
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17楼2013-07-17 11:20:21
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何超

金虫 (正式写手)
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17楼: Originally posted by zhgjsyzhyang at 2013-07-17 11:20:21
第一个问题：可以看一下设置里面有没有信号放大之类的，普通紫外检测不会出现在线波长和离线波长不一致的情况，没碰到过在线和离线不一致的问题。至于主峰前面有一个小峰，其实这种情况挺常见的，可能是柱子脏，可 ...

谢谢啦......
今天跟组长说了一下，组长点醒我了，我用的那个柱子是特制的，柱头很细，进样量太大了会在柱头堆积，就会影响柱效......
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18楼2013-07-17 20:37:36
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kkbyb

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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12楼: Originally posted by 何超 at 2013-07-14 23:55:07
前面说了，药典的方法，你见过药典的方法里有纯乙腈纯甲醇的吗？我的是甲醇-磷酸盐缓冲液（23：77）
做线性只能用不同浓度吗？自动进样的一个母液设置不同进样体积的方法不行吗？如果是有规定，能否指教一下出自何 ...

自从离开药学行业后就没太拜读过药典，所以考虑不周，但是如果药典有指出溶媒的话，我想也同样指出了进样体积，国内的行业暂时不很规矩，所以同一溶液改变体积进样在例行检查中也被很多部门采用，审查时也是睁一眼闭一眼放过的，如果你是做学位论文发文章最好你这么做得到你导师的肯定和支持，以免以后审查组专家对此提出质疑
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19楼2013-07-20 00:13:45
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ppandonghui11楼
2013-07-14 22:25  
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