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链霉菌 接合转移500金币求助
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我做链霉菌的接合转移已经有将近2年时间，方法是链霉菌遗传操作手册上的，并阅读文献进行改进。我几乎读遍了所有的关于这方面的文献，做了无数次尝试及实验条件优化，目前为止从未出现任何接合子，从未成功。 我在论坛里面也看了很懂做这方面工作的帖子，每次都在做不同的尝试，依然没有成功。 希望有经验的同学给以指导。一旦成功，愿意奉送高额金币。 |
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jiyannangxj
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2楼2013-07-13 18:01:32
kingsoo
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【答案】应助回帖
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你用的质粒是哪种？接合转移这种方法有效克服宿主对外源DNA的限制性修饰。不同链霉菌的最优条件不同，我可以把我之前优化的条件给你做参考。 受体：孢子热激后预萌发 取适量孢子悬液，直接50°C水浴热激10min，待冷却至室温后加入等体积的2×孢子预萌发培养基，28°C，180r/min摇床培养2-3h，离心收集孢子，并重新悬浮于适量的TES缓冲液中，待用。 供体：含目的质粒的ET12567（pUZ8002）过夜培养物转接到含有相应抗生素的LB中，37°C，180r/min培养至浓度为OD600=0.4-0.6时，收集菌体。用等体积的新鲜LB洗涤菌体两次（洗去抗生素），最后用0.1倍体积的LB悬浮备用。 接合转移：分别取100μL含目的质粒的ET12567（pUZ8002）和预萌发的孢子于eppendorf管中混匀静置2min，然后涂布于MS培养基上，28°C倒置培养。一段时间后用1mL含有浓度为50μg/mL的萘啶酮酸和相应浓度抗生素的水溶液均匀覆盖。3-5天后可观察有无转化子长出。 遗传转化是菌种改造的第一步，祝楼主早点做通。  |
13楼2013-07-15 20:27:08
kingsoo
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝月望宁: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，这个已经注意了。不知道受体菌有什么要求？ 2013-07-15 09:22:46
laozuzunzhe: 金币+3, good！ 2013-07-15 11:24:25
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laozuzunzhe: 金币+3, good！ 2013-07-15 11:24:25
| 接合转移应该是链霉菌遗传转化方法里面比较好做，而且是转化效率比较高的。我之前做这方面的，转化成功了。接合转移把握好以下几个方面：受体形式，供体菌的培养时间，受体与供体的混合比例，抗生素覆盖浓度，抗生素覆盖时间这几个因素应该就没问题，一个因素把握不好可能就做不出来。我当时是对每个条件进行了优化。不同菌株的最优化条件也不同，所以不知道楼主是问题出在哪一步了。 |
6楼2013-07-14 21:43:15
19楼2013-07-16 20:20:12
|
多谢！ 是这样的我们这个菌株还未公开，算是专利。。。。。并非我不信任您。 您说有做接合转移的设备？这个还需要什么设备吗？能否给我一份贵实验室详尽的实验步骤，包括细节？ 感谢您的回复，如果可以成功我给您500金币，说道做到。如果不方面的话我邮箱是lanyuekun@163.com，希望您能帮助！ |
3楼2013-07-13 20:39:33
jiyannangxj
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