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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 链霉菌 接合转移500金币求助
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lmhzy1987 at 2013-07-15 04:45:38
我觉得楼主你该把你的protocol放出来让大家分析下，我个人经验是首先孢子量要够要新鲜，然后接合转移的大肠杆菌也要新鲜活力好，可以尝试在不同的时间段涂抗对比下

就是常规的方法，链霉菌操作手册上的，没有多大改动。
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11楼2013-07-15 18:38:43
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kingsoo at 2013-07-14 14:43:15
接合转移应该是链霉菌遗传转化方法里面比较好做，而且是转化效率比较高的。我之前做这方面的，转化成功了。接合转移把握好以下几个方面：受体形式，供体菌的培养时间，受体与供体的混合比例，抗生素覆盖浓度，抗生素 ...

你怎么不回复了呢？
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12楼2013-07-15 18:39:39
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kingsoo

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝月望宁 at 2013-07-15 18:39:39
你怎么不回复了呢？...

你用的质粒是哪种？接合转移这种方法有效克服宿主对外源DNA的限制性修饰。不同链霉菌的最优条件不同，我可以把我之前优化的条件给你做参考。
受体：孢子热激后预萌发
取适量孢子悬液，直接50°C水浴热激10min，待冷却至室温后加入等体积的2×孢子预萌发培养基，28°C，180r/min摇床培养2-3h，离心收集孢子，并重新悬浮于适量的TES缓冲液中，待用。
供体：含目的质粒的ET12567（pUZ8002）过夜培养物转接到含有相应抗生素的LB中，37°C，180r/min培养至浓度为OD600=0.4-0.6时，收集菌体。用等体积的新鲜LB洗涤菌体两次（洗去抗生素），最后用0.1倍体积的LB悬浮备用。
接合转移：分别取100μL含目的质粒的ET12567（pUZ8002）和预萌发的孢子于eppendorf管中混匀静置2min，然后涂布于MS培养基上，28°C倒置培养。一段时间后用1mL含有浓度为50μg/mL的萘啶酮酸和相应浓度抗生素的水溶液均匀覆盖。3-5天后可观察有无转化子长出。

遗传转化是菌种改造的第一步，祝楼主早点做通。
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13楼2013-07-15 20:27:08
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 蓝月望宁 at 2013-07-15 18:37:35
那该如何是好？有什么办法解决吗？...

那株菌的操作我们已经放弃，因为没有更好的想法
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14楼2013-07-16 08:39:27
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syn1985

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
蓝月望宁: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-07-16 15:34:40
换个培养基试试吧 MS并不一定是最合适的 我当初就是怎么也做不出来 换了就出来了的 祝顺利
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15楼2013-07-16 11:41:44
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by syn1985 at 2013-07-16 04:41:44
换个培养基试试吧 MS并不一定是最合适的 我当初就是怎么也做不出来 换了就出来了的 祝顺利

我把能查到的培养基几乎都用过了，还是没结果，有什么好办法吗？您用的哪种培养基？配方方便给我吗？
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16楼2013-07-16 15:35:59
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by kingsoo at 2013-07-15 13:27:08
你用的质粒是哪种？接合转移这种方法有效克服宿主对外源DNA的限制性修饰。不同链霉菌的最优条件不同，我可以把我之前优化的条件给你做参考。
受体：孢子热激后预萌发
取适量孢子悬液，直接50°C水浴热激10min，待 ...

复制型pJTU1278，pUWL201和整合性的pSET152质粒都用过。您用的什么质粒？
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17楼2013-07-16 15:37:56
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 蓝月望宁 at 2013-07-16 15:35:59
我把能查到的培养基几乎都用过了，还是没结果，有什么好办法吗？您用的哪种培养基？配方方便给我吗？...

估计我试过的培养基你也试过吧 GSY和2CMY
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18楼2013-07-16 17:07:00
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by syn1985 at 2013-07-16 10:07:00
估计我试过的培养基你也试过吧 GSY和2CMY...

谢谢，请问GSY是什么培养基，在下没有找到。
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19楼2013-07-16 20:20:12
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kingsoo

木虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 蓝月望宁 at 2013-07-16 15:37:56
复制型pJTU1278，pUWL201和整合性的pSET152质粒都用过。您用的什么质粒？...

我用的pIB139是以质粒pSET152为基础，在其多克隆位点插入链霉菌常用的强启动子PermE*构建而成。
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20楼2013-07-16 21:44:04
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