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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 链霉菌 接合转移500金币求助
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)

[求助] 链霉菌 接合转移500金币求助

我做链霉菌的接合转移已经有将近2年时间，方法是链霉菌遗传操作手册上的，并阅读文献进行改进。我几乎读遍了所有的关于这方面的文献，做了无数次尝试及实验条件优化，目前为止从未出现任何接合子，从未成功。
我在论坛里面也看了很懂做这方面工作的帖子，每次都在做不同的尝试，依然没有成功。
希望有经验的同学给以指导。一旦成功，愿意奉送高额金币。
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1楼 2013-07-13 10:04:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jiyannangxj

至尊木虫 (著名写手)

美女搞科研

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把你的链霉菌培养到平板，我实验室有相关设备可以为你做结合，有需要的话，回复我。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-07-13 18:01:32
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kingsoo

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝月望宁 at 2013-07-15 18:39:39
你怎么不回复了呢？...

你用的质粒是哪种？接合转移这种方法有效克服宿主对外源DNA的限制性修饰。不同链霉菌的最优条件不同，我可以把我之前优化的条件给你做参考。
受体：孢子热激后预萌发
取适量孢子悬液，直接50°C水浴热激10min，待冷却至室温后加入等体积的2×孢子预萌发培养基，28°C，180r/min摇床培养2-3h，离心收集孢子，并重新悬浮于适量的TES缓冲液中，待用。
供体：含目的质粒的ET12567（pUZ8002）过夜培养物转接到含有相应抗生素的LB中，37°C，180r/min培养至浓度为OD600=0.4-0.6时，收集菌体。用等体积的新鲜LB洗涤菌体两次（洗去抗生素），最后用0.1倍体积的LB悬浮备用。
接合转移：分别取100μL含目的质粒的ET12567（pUZ8002）和预萌发的孢子于eppendorf管中混匀静置2min，然后涂布于MS培养基上，28°C倒置培养。一段时间后用1mL含有浓度为50μg/mL的萘啶酮酸和相应浓度抗生素的水溶液均匀覆盖。3-5天后可观察有无转化子长出。

遗传转化是菌种改造的第一步，祝楼主早点做通。
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13楼2013-07-15 20:27:08
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kingsoo

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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蓝月望宁: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，这个已经注意了。不知道受体菌有什么要求？ 2013-07-15 09:22:46
laozuzunzhe: 金币+3, good！ 2013-07-15 11:24:25
接合转移应该是链霉菌遗传转化方法里面比较好做，而且是转化效率比较高的。我之前做这方面的，转化成功了。接合转移把握好以下几个方面：受体形式，供体菌的培养时间，受体与供体的混合比例，抗生素覆盖浓度，抗生素覆盖时间这几个因素应该就没问题，一个因素把握不好可能就做不出来。我当时是对每个条件进行了优化。不同菌株的最优化条件也不同，所以不知道楼主是问题出在哪一步了。
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6楼2013-07-14 21:43:15
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by syn1985 at 2013-07-16 10:07:00
估计我试过的培养基你也试过吧 GSY和2CMY...

谢谢，请问GSY是什么培养基，在下没有找到。
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19楼2013-07-16 20:20:12
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普通回帖

蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiyannangxj at 2013-07-13 11:01:32
把你的链霉菌培养到平板，我实验室有相关设备可以为你做结合，有需要的话，回复我。

多谢！
是这样的我们这个菌株还未公开，算是专利。。。。。并非我不信任您。
您说有做接合转移的设备？这个还需要什么设备吗？能否给我一份贵实验室详尽的实验步骤，包括细节？
感谢您的回复，如果可以成功我给您500金币，说道做到。如果不方面的话我邮箱是lanyuekun@163.com，希望您能帮助！
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3楼2013-07-13 20:39:33
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jiyannangxj

至尊木虫 (著名写手)

美女搞科研

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 蓝月望宁 at 2013-07-13 20:39:33
多谢！
是这样的我们这个菌株还未公开，算是专利。。。。。并非我不信任您。
您说有做接合转移的设备？这个还需要什么设备吗？能否给我一份贵实验室详尽的实验步骤，包括细节？
感谢您的回复，如果可以成功我给 ...

不好意思啊，我们实验室实验步骤是长期积累的经验，属于课题组的内部机密，我们实验室已经为外人做过好多次了，有偿结合，技术不外传的，请原谅！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-07-13 23:37:52
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiyannangxj at 2013-07-13 16:37:52
不好意思啊，我们实验室实验步骤是长期积累的经验，属于课题组的内部机密，我们实验室已经为外人做过好多次了，有偿结合，技术不外传的，请原谅！
...

哦这样啊。多谢了！真是太可惜了。请问多少钱可以做一次？做不成怎么办？还有贵实验室是哪座高校？还是研究所？
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5楼2013-07-14 10:14:35
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kingsoo at 2013-07-14 14:43:15
接合转移应该是链霉菌遗传转化方法里面比较好做，而且是转化效率比较高的。我之前做这方面的，转化成功了。接合转移把握好以下几个方面：受体形式，供体菌的培养时间，受体与供体的混合比例，抗生素覆盖浓度，抗生素 ...

很感谢您的回复！
您说的这些细节我都注意了，请问在受体菌方面，有什么具体要求？受体菌甲基化修饰太强，质粒进去之后被降解，或者不能表达，如何能去除这些不利条件？
你能不能给我一份你自己做的详细的步骤，包括你给我提的这些细节问题？
会有大量金币相送！
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7楼2013-07-15 09:25:24
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lmhzy1987

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝月望宁: 金币+2, ★★★很有帮助, 多谢。 2013-07-15 18:36:55
我觉得楼主你该把你的protocol放出来让大家分析下，我个人经验是首先孢子量要够要新鲜，然后接合转移的大肠杆菌也要新鲜活力好，可以尝试在不同的时间段涂抗对比下
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头疼的文库
8楼2013-07-15 11:45:38
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝月望宁: 金币+1, ★有帮助 2013-07-15 18:37:13
蓝月望宁: 金币+1, ★有帮助 2013-07-15 18:38:08
有些菌体的结合转移就是比较难做，我们做过两株，其中一种按常规方法很顺利的就能够实现，而另一株通过多种方式，也探索过多种条件，没有任何结果。
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9楼2013-07-15 16:48:53
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by joan198108 at 2013-07-15 09:48:53
有些菌体的结合转移就是比较难做，我们做过两株，其中一种按常规方法很顺利的就能够实现，而另一株通过多种方式，也探索过多种条件，没有任何结果。

那该如何是好？有什么办法解决吗？
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10楼2013-07-15 18:37:35
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