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1楼2013-07-08 09:51:19

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

BioEPI: 4
应助: 1662 (讲师)
金币: 8693.8
红花: 72
帖子: 3516
在线: 456小时
虫号: 1614001
注册: 2012-02-13
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
浮帅古: 金币+30, ★★★很有帮助, 谢谢，我今天再试最后一次 2013-07-11 16:03:03

引用回帖:

10楼: Originally posted by 浮帅古 at 2013-07-09 17:39:43
感谢cicelyzh老师的建议，阳性对照我每次上10微克然后加loading buffer补齐，样品我50到120都试过，唯一跑出来那次是上了50微克。

这次我分别用了两家公司的GFP抗体，结果都和以前一样，都是只有非特异性条带， ...

不知道你提取样品的方法是怎样的，一般如果在变性条件下提取，无需蛋白酶抑制剂。如果在native条件下，如果操作时间很长，建议使用蛋白酶抑制剂。如果不使用的话尽量在冰上操作。

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11楼2013-07-10 00:46:58

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

BioEPI: 4
应助: 1662 (讲师)
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红花: 72
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虫号: 1614001
注册: 2012-02-13
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-08 16:27:29
silicare: BioEPI+1 2013-07-09 09:47:57

我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白样品的反复冻融对有些蛋白来说可能会降解比较严重，也可能导致western失败。

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2楼2013-07-08 14:02:18

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浮帅古

铜虫 (小有名气)

BioEPI: 1
应助: 7 (幼儿园)
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虫号: 1210918
注册: 2011-02-23
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

引用回帖:

2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

我的实验是用慢病毒制备转基因鸡，阳性对照是细胞实验时用病毒感染细胞后提取的蛋白，后来在鸡的组织蛋白样品中杂到与细胞实验相同的条带，所以认定这段时间杂出的下面那排很粗的是非特异性条带。
这段时间WB样品用的是从鸡蛋里提的蛋白，我分别用PEG6000和氯仿两种方法提取，PEG法始终未杂出目的条带，氯仿法提的就杂出一次如图的条带。GFP抗体是买的博尔迈公司的，杂浓度很低的标准品都没问题的。
蛋白样品反复冻融确实会降解，但是我只冻融两次应该不会完全降解啊，而且样品溶解都是插在冰盒里的。我又重新提蛋白的还没杂出来，过一个月就该汇报工作了，很焦急。