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western blotting 显影曝光结果不理想，求高手指点
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最近做western blotting每次到最后显影曝光结果都不是很理想，蛋白样品量有限，属于小分子蛋白22kd，抗体由国产换为进口抗体，ECL为Pierce的，显影液和定影液为博士德的。 求高手指点如何在蛋白浓度较低的样品中把WB做好？ 显影定影曝光方面为手动暗室曝光，有什么好的实验技巧，求分享，谢谢！ 也可以推介一下好的显影液和定影液， |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
aksand: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-07-02 14:37:29
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aksand: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-07-02 14:37:29
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相信你多做几遍效果就出来了。我之前也是一直掌握不好上样量以及曝光时间，做了近2周终于做出比较漂亮的条带了。我个人总结主要有下面几点： 1、蛋白的提取很重要，超声破碎度要掌握好，当然我是用来做CoIP的，超声破包时不能太过，否则影响蛋白之间的互作。如果只是提取总蛋白，可以尽量彻底超声破碎，这样提取的目的蛋白浓度会高一些。 2、上样量，如果蛋白丰度较低，可以加大上样量，1.0mm的胶不行就换1.5mm的，这样每个上样孔可以加到40-50ul。 3、一抗时间：如果蛋白丰度低，可以延长杂交时间，过夜也行。 4、洗涤：洗涤非常关键，如果洗不好，背景特别高。我一般是先用5ml的枪吸取PBST冲洗3遍，再加入较多的PBST快速洗2min，然后是10min，4个5min。 5、曝光时间，这个很重要.我们实验室也是手动曝光的，要根据经验而来。一般情况下要是能够观察到荧光的，那么说明信号强，可以减少曝光时间，一般压2-3张片子，10S左右就可以了。选择最好的一张。如果看不到荧光，说明信号弱，可以曝光10min，我们有曝光30min的，视情况而定。 祝好运！ |
11楼2013-07-02 11:01:41
cicelyzh
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12楼2013-07-02 12:11:20
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gyesang
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