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aksand

银虫 (正式写手)

[求助] western blotting 显影曝光结果不理想，求高手指点

最近做western blotting每次到最后显影曝光结果都不是很理想，蛋白样品量有限，属于小分子蛋白22kd，抗体由国产换为进口抗体，ECL为Pierce的，显影液和定影液为博士德的。
求高手指点如何在蛋白浓度较低的样品中把WB做好？
显影定影曝光方面为手动暗室曝光，有什么好的实验技巧，求分享，谢谢！
也可以推介一下好的显影液和定影液，
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1楼 2013-07-01 21:39:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xiayongxiu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aksand: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-07-02 14:37:29
引用回帖:
10楼: Originally posted by aksand at 2013-07-02 10:44:10
可惜没有成像仪，如果信号弱一点，手动想爆出来就相当困难！
博士师姐的男朋友是华西的，她去那边用仪器爆出来的很漂亮，很弱的信号也有，
可惜我们只有苦逼的手动曝光！...

相信你多做几遍效果就出来了。我之前也是一直掌握不好上样量以及曝光时间，做了近2周终于做出比较漂亮的条带了。我个人总结主要有下面几点：
1、蛋白的提取很重要，超声破碎度要掌握好，当然我是用来做CoIP的，超声破包时不能太过，否则影响蛋白之间的互作。如果只是提取总蛋白，可以尽量彻底超声破碎，这样提取的目的蛋白浓度会高一些。
2、上样量，如果蛋白丰度较低，可以加大上样量，1.0mm的胶不行就换1.5mm的，这样每个上样孔可以加到40-50ul。
3、一抗时间：如果蛋白丰度低，可以延长杂交时间，过夜也行。
4、洗涤：洗涤非常关键，如果洗不好，背景特别高。我一般是先用5ml的枪吸取PBST冲洗3遍，再加入较多的PBST快速洗2min，然后是10min，4个5min。
5、曝光时间，这个很重要.我们实验室也是手动曝光的，要根据经验而来。一般情况下要是能够观察到荧光的，那么说明信号强，可以减少曝光时间，一般压2-3张片子，10S左右就可以了。选择最好的一张。如果看不到荧光，说明信号弱，可以曝光10min，我们有曝光30min的，视情况而定。
祝好运！
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一切都要靠自己努力
11楼2013-07-02 11:01:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aksand: 金币+3 2013-07-02 08:59:58
你说的不理想是什么情况？信号弱还是背景深？
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2楼2013-07-02 00:34:30
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aksand: 金币+3, ★有帮助 2013-07-02 10:41:51
手动暗室的曝光的效果没有成像仪好，有条件的话，成像仪试试
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6楼2013-07-02 08:59:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
aksand: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-07-02 14:36:16
引用回帖:
9楼: Originally posted by aksand at 2013-07-02 10:41:15
有什么好的手动曝光技巧，求分享哈！...

其实也算不上什么，就是暴光时间和显影时间在一定范围内是可以互相弥补的，就是在显影时，通过暗室中微弱的红光下随时观察胶片develop的情况，当隐约出现条带后终止显影。下次暴光的时候可以根据显影的速度缩短暴光时间。当然显影的速度也和显影液的新旧程度有关，如果用固定的时间显影可能会比较浪费胶片。这种手动显影定影已经很少了，很多地方用机器洗胶片，或者用荧光成像仪直接出图片。
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12楼2013-07-02 12:11:20
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
aksand: 金币+3, ★有帮助 2013-07-02 19:53:41
引用回帖:
10楼: Originally posted by aksand at 2013-07-02 11:44:10
可惜没有成像仪，如果信号弱一点，手动想爆出来就相当困难！
博士师姐的男朋友是华西的，她去那边用仪器爆出来的很漂亮，很弱的信号也有，
可惜我们只有苦逼的手动曝光！...

是哦，你压片的时间是否可以变长点，或者多压几张，每张时间短点试试。
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15楼2013-07-02 15:52:04
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普通回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aksand: 金币+5 2013-07-02 08:59:04
myprayer: 金币+1, 回答很好，perfect 2013-07-02 09:13:47
pierce也有个增强液可买，能够显着增强信号，但问题也来了，背景被曝的也深，不过你可以试试
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-07-02 02:41:29
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biomed_fanyi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aksand: 金币+5 2013-07-02 08:58:56
aksand(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-02 09:13:29
多少浓度的胶？ 22kd 和light chain挺近的，如果为了增加信号抗体浓了，可能反而会被屏蔽。 你给个截图看看才知道怎么改进下
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4楼2013-07-02 08:03:53
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944610816

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aksand: 金币+10, ★有帮助, 谢谢哦！ 2013-07-02 08:58:01
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-02 09:13:17
增大蛋白上样量，80V跑到底可以尽量压平条带，再曝光试试看？
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5楼2013-07-02 08:43:25
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aksand

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 00:34:30
你说的不理想是什么情况？信号弱还是背景深？

信号很弱，曝光不理想，曝光时间久，背景加深！
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7楼2013-07-02 08:59:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-02 10:05:13
aksand: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-02 10:41:28
引用回帖:
7楼: Originally posted by aksand at 2013-07-02 08:59:52
信号很弱，曝光不理想，曝光时间久，背景加深！...

增加上样量，实在不行的话就调整一抗浓度。有时候目标蛋白的丰度不高，加上一抗的效价又不是很好的话，也是没有太好的办法的。手动曝光也需要点小技巧。
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8楼2013-07-02 09:33:56
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aksand

银虫 (正式写手)
内容已删除
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9楼2013-07-02 10:41:15
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aksand

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ericyo918 at 2013-07-02 08:59:21
手动暗室的曝光的效果没有成像仪好，有条件的话，成像仪试试

可惜没有成像仪，如果信号弱一点，手动想爆出来就相当困难！
博士师姐的男朋友是华西的，她去那边用仪器爆出来的很漂亮，很弱的信号也有，
可惜我们只有苦逼的手动曝光！
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10楼2013-07-02 10:44:10
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