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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western blotting 显影曝光结果不理想，求高手指点
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xiayongxiu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aksand: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-07-02 14:37:29
引用回帖:
10楼: Originally posted by aksand at 2013-07-02 10:44:10
可惜没有成像仪，如果信号弱一点，手动想爆出来就相当困难！
博士师姐的男朋友是华西的，她去那边用仪器爆出来的很漂亮，很弱的信号也有，
可惜我们只有苦逼的手动曝光！...

相信你多做几遍效果就出来了。我之前也是一直掌握不好上样量以及曝光时间，做了近2周终于做出比较漂亮的条带了。我个人总结主要有下面几点：
1、蛋白的提取很重要，超声破碎度要掌握好，当然我是用来做CoIP的，超声破包时不能太过，否则影响蛋白之间的互作。如果只是提取总蛋白，可以尽量彻底超声破碎，这样提取的目的蛋白浓度会高一些。
2、上样量，如果蛋白丰度较低，可以加大上样量，1.0mm的胶不行就换1.5mm的，这样每个上样孔可以加到40-50ul。
3、一抗时间：如果蛋白丰度低，可以延长杂交时间，过夜也行。
4、洗涤：洗涤非常关键，如果洗不好，背景特别高。我一般是先用5ml的枪吸取PBST冲洗3遍，再加入较多的PBST快速洗2min，然后是10min，4个5min。
5、曝光时间，这个很重要.我们实验室也是手动曝光的，要根据经验而来。一般情况下要是能够观察到荧光的，那么说明信号强，可以减少曝光时间，一般压2-3张片子，10S左右就可以了。选择最好的一张。如果看不到荧光，说明信号弱，可以曝光10min，我们有曝光30min的，视情况而定。
祝好运！
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一切都要靠自己努力
11楼2013-07-02 11:01:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
aksand: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-07-02 14:36:16
引用回帖:
9楼: Originally posted by aksand at 2013-07-02 10:41:15
有什么好的手动曝光技巧，求分享哈！...

其实也算不上什么，就是暴光时间和显影时间在一定范围内是可以互相弥补的，就是在显影时，通过暗室中微弱的红光下随时观察胶片develop的情况，当隐约出现条带后终止显影。下次暴光的时候可以根据显影的速度缩短暴光时间。当然显影的速度也和显影液的新旧程度有关，如果用固定的时间显影可能会比较浪费胶片。这种手动显影定影已经很少了，很多地方用机器洗胶片，或者用荧光成像仪直接出图片。
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12楼2013-07-02 12:11:20
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aksand

银虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by xiayongxiu at 2013-07-02 11:01:41
相信你多做几遍效果就出来了。我之前也是一直掌握不好上样量以及曝光时间，做了近2周终于做出比较漂亮的条带了。我个人总结主要有下面几点：
1、蛋白的提取很重要，超声破碎度要掌握好，当然我是用来做CoIP的，超 ...

非常感谢！
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13楼2013-07-02 14:37:40
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aksand

银虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 12:11:20
其实也算不上什么，就是暴光时间和显影时间在一定范围内是可以互相弥补的，就是在显影时，通过暗室中微弱的红光下随时观察胶片develop的情况，当隐约出现条带后终止显影。下次暴光的时候可以根据显影的速度缩短暴光 ...

非常感谢！
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14楼2013-07-02 14:37:51
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
aksand: 金币+3, ★有帮助 2013-07-02 19:53:41
引用回帖:
10楼: Originally posted by aksand at 2013-07-02 11:44:10
可惜没有成像仪，如果信号弱一点，手动想爆出来就相当困难！
博士师姐的男朋友是华西的，她去那边用仪器爆出来的很漂亮，很弱的信号也有，
可惜我们只有苦逼的手动曝光！...

是哦，你压片的时间是否可以变长点，或者多压几张，每张时间短点试试。
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15楼2013-07-02 15:52:04
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抓药的

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by xiayongxiu at 2013-07-02 11:01:41
相信你多做几遍效果就出来了。我之前也是一直掌握不好上样量以及曝光时间，做了近2周终于做出比较漂亮的条带了。我个人总结主要有下面几点：
1、蛋白的提取很重要，超声破碎度要掌握好，当然我是用来做CoIP的，超 ...

你是能观察到条带的荧光还是整个膜发出的荧光

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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16楼2014-12-30 16:14:11
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