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我晴天一片

新虫 (初入文坛)

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[求助] 我做了3周的载体构建了就是构建不上，求助啊

我做了3周的载体构建了就是构建不上，转化后会有菌落也能摇起来，提完质粒用双酶切鉴定跑胶后什么条带都没有了，现在郁闷至极，不知道哪里出问题了，各位大侠求助啊！！！

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1楼 2013-06-23 11:25:43

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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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【答案】应助回帖

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"酶切体系10微，基因载体是按浓度的3:1连的，然后1微的T4连接酶，1微的buffer。"
你是用T4 DNA连接酶连接的，对吧？那么很可能问题出在T4 DNA连接酶上，T4 DNA连接酶极易失活：要用新的T4 DNA连接酶；不能在室温下操作，要在冰上操作；T4 DNA连接酶加入到反应体系后，不要使用漩涡混合器混合，这将引起T4 DNA连接酶失活，用微量移液器吹打的方式混合；不能对于T4 DNA连接酶加热；反应体系小点，这样加入的T4 DNA连接酶的总量也少些，加入到反应体系的甘油也少，必要的话可用低温下透析方法去掉T4 DNA连接酶试剂中的甘油。