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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 天然药物化学 » 多糖的除蛋白问题
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chong//虫

铜虫 (小有名气)

[求助] 多糖的除蛋白问题

大家好： 想问大家一个问题，我在对水提的虫草多糖进行除蛋白时，除蛋白前紫外检测的时候200-400nm之间没有峰吸收 ，曲线很平稳，只是快要到200即接近纵轴的时候曲线急剧的上升。之后我又用胰蛋白酶处理了三次，离心时有少量的白色沉淀，然后我又用savege法处理了4次，此时中间层看不到有白色絮状物，我认为蛋白除干净了，可紫外的时候曲线形状和除蛋白前一样，没有变化，只是在260nm和280nm处的吸光度变大了。之前我的材料用80%的乙醇回流提取过，可是我查了80%的乙醇只能除去一些色素、小分子的化合物、单糖和一些低聚糖等，不会除去蛋白的呀，处理前和处理后分别茚三酮颜色反应也不明显，要说没有蛋白不可能的呀，那我savege法处理的时候中间那絮状物是什么呀？是不是我操作错了还是？希望有做过的同仁们能给指点一下，麻烦大家了！
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1楼2013-06-20 10:59:47
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chong//虫

铜虫 (小有名气)
不好意思，前面打错了，除蛋白前茚三酮反应紫色很明显，经胰蛋白酶，savege法处理后，颜色反应呈很浅的紫色，就是有点灰灰的感觉，那为什么紫外看不出来变化呢？我想象的是除蛋白前有峰吸收，除蛋白后曲线变平稳，可是曲线都是平稳的，怎么回事？
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2楼2013-06-20 11:11:53
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拜仁主义

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有些蛋白是和多糖结合在一起的糖蛋白，很难除去的，我一般都用1%的木瓜蛋白酶50摄氏度水浴一小时，然后用SEVAG法脱蛋白，在摇床上剧烈震摇20分钟左右，要这么弄个10几次才算完全脱干净蛋白，之间剧烈震摇还造成了乳化，损失了不少多糖，痛苦......感觉楼主好像脱的有点太轻松了点，4次个人觉的是不够的，即使中间已经看不到变性蛋白。
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chong//虫
天然药物药理。。。。。。。
3楼2013-06-20 20:40:44
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蓝龙教主

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
除蛋白的过程会损失40%左右的粗提物，仔细想想，植物来源的多糖里面是不可能含有这么多的蛋白的。当蛋白去除的时候，我以前采用了蛋白酶与正丁醇，氯仿合用的办法清除。
多糖的分离纯化是个缓慢的过程，但是个人认为，可能糖蛋白还是有一定活性的，糖蛋白应该还保留有蛋白的活性，那么可以试试盐析，或者分离蛋白的方法，这些东西我没有试过，但是我觉得应该具有可行性。
在盐溶液中，多糖的溶解度还是比较好的
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chong//虫
4楼2013-06-20 23:35:55
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chong//虫

铜虫 (小有名气)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 拜仁主义 at 2013-06-20 20:40:44
有些蛋白是和多糖结合在一起的糖蛋白，很难除去的，我一般都用1%的木瓜蛋白酶50摄氏度水浴一小时，然后用SEVAG法脱蛋白，在摇床上剧烈震摇20分钟左右，要这么弄个10几次才算完全脱干净蛋白，之间剧烈震摇还造成了乳 ...

非常谢谢，我把多糖溶解在水里，我没有木瓜蛋白酶，用的是胰蛋白酶，它的水解条件好像是PH=7.8-8.1，我没有调节PH，直接在50℃水浴4小时，酶法我处理了3次，然后4次SEVAG法处理，就看不到变性蛋白了，而且我的溶液颜色还浅了很多，透亮透亮的，我想问下此法是不是还可以出去部分色素，还是我的糖少了？我昨天重复做了一遍，除蛋白前260nm和280nm处有峰，很小，除蛋白后平了很多，是不是证明蛋白除去了很多？还是要求此处的吸收度要小于某个值？我的纵坐标最大值设置的是2.5，这个纵坐标最大值设置有什么具体的规定吗？非常谢谢！
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5楼2013-06-21 16:46:51
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chong//虫

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 蓝龙教主 at 2013-06-20 23:35:55
除蛋白的过程会损失40%左右的粗提物，仔细想想，植物来源的多糖里面是不可能含有这么多的蛋白的。当蛋白去除的时候，我以前采用了蛋白酶与正丁醇，氯仿合用的办法清除。
多糖的分离纯化是个缓慢的过程，但是个人认 ...

非常谢谢您的提示，我一师兄以前做过，分离纯化出来的东西不含蛋白质和核酸，是不是就可以认为我不用考虑糖蛋白的问题了？
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6楼2013-06-21 16:54:18
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大白菜1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 拜仁主义 at 2013-06-20 20:40:44
有些蛋白是和多糖结合在一起的糖蛋白，很难除去的，我一般都用1%的木瓜蛋白酶50摄氏度水浴一小时，然后用SEVAG法脱蛋白，在摇床上剧烈震摇20分钟左右，要这么弄个10几次才算完全脱干净蛋白，之间剧烈震摇还造成了乳 ...

我想问下，你用木瓜蛋白酶脱蛋白，木瓜蛋白酶是否会含有多糖...我做脱蛋白很久了，之前从来没考虑过木瓜蛋白酶能不能含多糖，可是最近由于老师让我把纯化过的多糖样品用木瓜蛋白酶再次脱蛋白，因为不放心就测了下，我买的木瓜蛋白酶里边多糖真心多啊！！想问问你怎么看这问题
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7楼2013-06-24 13:09:00
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chong//虫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 大白菜1989 at 2013-06-24 13:09:00
我想问下，你用木瓜蛋白酶脱蛋白，木瓜蛋白酶是否会含有多糖...我做脱蛋白很久了，之前从来没考虑过木瓜蛋白酶能不能含多糖，可是最近由于老师让我把纯化过的多糖样品用木瓜蛋白酶再次脱蛋白，因为不放心就测了下， ...

蛋白酶应该不含有多糖吧，我想问下你是怎么测的木瓜蛋白酶里面的多糖的
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8楼2013-06-25 19:20:57
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琥珀天千

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chong//虫 at 2013-06-21 16:46:51
非常谢谢，我把多糖溶解在水里，我没有木瓜蛋白酶，用的是胰蛋白酶，它的水解条件好像是PH=7.8-8.1，我没有调节PH，直接在50℃水浴4小时，酶法我处理了3次，然后4次SEVAG法处理，就看不到变性蛋白了，而且我的溶液 ...

你好，请问你当时用的胰蛋白酶浓度及添加量是多少啊
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9楼2017-05-14 12:30:31
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