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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 已知蛋白质38KD，如何获得其全长基因序列？
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宸琦qq

新虫 (初入文坛)

[求助] 已知蛋白质38KD，如何获得其全长基因序列？

血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康和寿命。由血栓引起的常见疾病主要有急性心肌梗塞、脑血栓和静脉血栓塞等。目前，临床上治疗血栓栓塞性疾病的首选方法是溶栓疗法，此法具有死亡率低、费用少等优点，更适合我国国情。因此近年来人们一直热衷于研究开发新的经济、适用、有效、无毒副作用的溶栓药物。我们最近从豆豉中筛选到一株能分泌高效水解血纤维蛋白（血栓的主要成分）的酶的芽孢杆菌菌株，经SDS-PAGE鉴定，该溶栓酶的分子量约38 kD 。但至今还没有见到该菌产溶栓酶的报道，也没有该酶基因的任何资料,请详细设计一株能高产分泌型溶栓酶的基因工程菌的构建路线，内容包括目的基因的克隆、重组、表达。
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1楼 2013-06-16 22:46:05
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

顺便说一句：用阶梯法测定蛋白质或者多肽的序列，是结合质谱和Edaman降解的测序方法，其费用也不低。
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11楼2013-09-11 21:00:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-17 13:57:28
先把蛋白质的氨基酸序列转变为核苷酸序列，然后：

5’-RACE，基因组文库筛选出完整基因，反向PCR，染色体步移等即可获得全基因序列。具体文献和Procotols，查分子克隆。

Molecular cloning--Laboratory manuals(2001)3rd edition（3 Volumes) Free
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5998393

获得全序列基因之后，就构建载体，对构建的载体进行检测以确保载体构建成功（可以电泳或者直接测序），导入工程细胞（电转化，氯化钙等），诱导载体上的目的基因表达，筛选表达目的基因的工程细胞（阳性克隆），大规模培养表达目的基因的工程细胞（阳性克隆），最后粉碎细胞或者分离分泌表达产物，复性和分离目的蛋白质，质检，临床前试验，临床1-3期实验。

具体文献和Procotols，查阅有关基因工程的实验手册。
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2楼2013-06-17 01:41:25
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-17 13:57:38
把那个38kDa的蛋白从胶上挖出来送质谱测序, 这样你会得到一部分氨基酸序列的信息. 然后参考一楼的答复, 根据这些蛋白片段序列设计引物做5' 和 3' RACE.
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3楼2013-06-17 05:27:56
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许许小静

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-06-17 05:27:56
把那个38kDa的蛋白从胶上挖出来送质谱测序, 这样你会得到一部分氨基酸序列的信息. 然后参考一楼的答复, 根据这些蛋白片段序列设计引物做5' 和 3' RACE.

挖出来的这一条 要是 不能 保证 是纯的一个蛋白  做质谱 能得到 氨基酸信息吗？
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4楼2013-06-18 10:30:59
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