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已知蛋白质38KD，如何获得其全长基因序列？
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| 血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康和寿命。由血栓引起的常见疾病主要有急性心肌梗塞、脑血栓和静脉血栓塞等。目前，临床上治疗血栓栓塞性疾病的首选方法是溶栓疗法，此法具有死亡率低、费用少等优点，更适合我国国情。因此近年来人们一直热衷于研究开发新的经济、适用、有效、无毒副作用的溶栓药物。我们最近从豆豉中筛选到一株能分泌高效水解血纤维蛋白（血栓的主要成分）的酶的芽孢杆菌菌株，经SDS-PAGE鉴定，该溶栓酶的分子量约38 kD 。但至今还没有见到该菌产溶栓酶的报道，也没有该酶基因的任何资料,请详细设计一株能高产分泌型溶栓酶的基因工程菌的构建路线，内容包括目的基因的克隆、重组、表达。 |
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 蛋白质生物学实验经验 | 核酸生物学实验经验 |
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bullfrog325
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先把蛋白质的氨基酸序列转变为核苷酸序列，然后： 5’-RACE，基因组文库筛选出完整基因，反向PCR，染色体步移等即可获得全基因序列。具体文献和Procotols，查分子克隆。 Molecular cloning--Laboratory manuals(2001)3rd edition（3 Volumes) Free http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5998393 获得全序列基因之后，就构建载体，对构建的载体进行检测以确保载体构建成功（可以电泳或者直接测序），导入工程细胞（电转化，氯化钙等），诱导载体上的目的基因表达，筛选表达目的基因的工程细胞（阳性克隆），大规模培养表达目的基因的工程细胞（阳性克隆），最后粉碎细胞或者分离分泌表达产物，复性和分离目的蛋白质，质检，临床前试验，临床1-3期实验。 具体文献和Procotols，查阅有关基因工程的实验手册。 |
2楼2013-06-17 01:41:25
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bullfrog325
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-11 11:49:08
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蛋白质可以用Edman降解法为基础的自动测序仪测序，也可以MS-MS测序（后者必须将蛋白质水解为18-25aa redues)的多肽，并且要用两种裂解方法，形成重叠肽）-----MS-MS测序费用太高，一般只测定N-末端16-20aa redues，然后到蛋白质数据库中搜索出全序列，再根据全序列的5’基因来RACE。 任何新蛋白质连序列不知道的话，能够被承认吗！？ 楼主已经做了SDS-PAGE，那就是蛋白质样品已经得到，并且能够从凝胶上会收到38kd，得到了蛋白质还不能送到有关生物技术公司测序-----------用Edman降解法为基础的自动测序仪测序在价格上能够承受。如果不是有钱太多而且基于花掉，MS-MS测序（后者必须将蛋白质水解为18-25aa redues)的多肽，并且要用两种裂解方法，形成重叠肽）还算了吧。 我就不知道OBM2013在说什么！！？？ |
9楼2013-09-11 09:33:35
凌波丽
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-11 11:49:14
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如果质谱对分子量是38 KD的全新的蛋白质（数据库里没有该蛋白质的一级结构）进行从头测序，一个氨基酸残基的分子量110，38 KD蛋白质有300+个氨基酸残基，串联质谱一次一般只能测定大约18-25个氨基酸残基的序列，至少要用两种方法裂解38 KD蛋白质，也就是串联质谱600+个氨基酸残基的蛋白质进行从头测序(断裂成为大约18-25个氨基酸残基的片段，可以有修饰成分，分别从头测序)。。。呵呵。。。估计是太有钱了。。。 串联质谱测多肽序列是用于在数据库中搜索的，还有测定修饰成分的。一般而言，质谱是测定蛋白质有限水解后的多肽的序列的，然后根据此多肽的序列道蛋白质数据库中去搜索到对应的蛋白质的信息。 一般的，如果蛋白质修饰成分比较多，可以事先测定蛋白质组成成分和用软件预测可能的修饰位点，在对蛋白质有限水解，对蛋白质修饰成分可能比较多的未知蛋白质用串联质谱从头测序，其他部分还是先用Edman降解的自动测序仪测序。 当然自己有质谱仪例外。 |
10楼2013-09-11 10:08:51
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