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已知蛋白质38KD，如何获得其全长基因序列？
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| 血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康和寿命。由血栓引起的常见疾病主要有急性心肌梗塞、脑血栓和静脉血栓塞等。目前，临床上治疗血栓栓塞性疾病的首选方法是溶栓疗法，此法具有死亡率低、费用少等优点，更适合我国国情。因此近年来人们一直热衷于研究开发新的经济、适用、有效、无毒副作用的溶栓药物。我们最近从豆豉中筛选到一株能分泌高效水解血纤维蛋白（血栓的主要成分）的酶的芽孢杆菌菌株，经SDS-PAGE鉴定，该溶栓酶的分子量约38 kD 。但至今还没有见到该菌产溶栓酶的报道，也没有该酶基因的任何资料,请详细设计一株能高产分泌型溶栓酶的基因工程菌的构建路线，内容包括目的基因的克隆、重组、表达。 |
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 蛋白质生物学实验经验 | 核酸生物学实验经验 |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-11 11:49:08
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-11 11:49:08
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蛋白质可以用Edman降解法为基础的自动测序仪测序，也可以MS-MS测序（后者必须将蛋白质水解为18-25aa redues)的多肽，并且要用两种裂解方法，形成重叠肽）-----MS-MS测序费用太高，一般只测定N-末端16-20aa redues，然后到蛋白质数据库中搜索出全序列，再根据全序列的5’基因来RACE。 任何新蛋白质连序列不知道的话，能够被承认吗！？ 楼主已经做了SDS-PAGE，那就是蛋白质样品已经得到，并且能够从凝胶上会收到38kd，得到了蛋白质还不能送到有关生物技术公司测序-----------用Edman降解法为基础的自动测序仪测序在价格上能够承受。如果不是有钱太多而且基于花掉，MS-MS测序（后者必须将蛋白质水解为18-25aa redues)的多肽，并且要用两种裂解方法，形成重叠肽）还算了吧。 我就不知道OBM2013在说什么！！？？ |
9楼2013-09-11 09:33:35
凌波丽
无虫
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-17 13:57:28
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先把蛋白质的氨基酸序列转变为核苷酸序列，然后： 5’-RACE，基因组文库筛选出完整基因，反向PCR，染色体步移等即可获得全基因序列。具体文献和Procotols，查分子克隆。 Molecular cloning--Laboratory manuals(2001)3rd edition（3 Volumes) Free http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5998393 获得全序列基因之后，就构建载体，对构建的载体进行检测以确保载体构建成功（可以电泳或者直接测序），导入工程细胞（电转化，氯化钙等），诱导载体上的目的基因表达，筛选表达目的基因的工程细胞（阳性克隆），大规模培养表达目的基因的工程细胞（阳性克隆），最后粉碎细胞或者分离分泌表达产物，复性和分离目的蛋白质，质检，临床前试验，临床1-3期实验。 具体文献和Procotols，查阅有关基因工程的实验手册。 |
2楼2013-06-17 01:41:25
bullfrog325
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