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崔永霞

铁虫 (小有名气)

[求助] 引物设计

请问各位前辈，根据近缘种属设计的引物用于反转录已获得cDNA的第一链是不是不可以加酶切位点啊？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
1楼 2013-05-21 10:03:31
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-22 01:00:31
1949stone: 金币+1, 同意 2013-05-22 08:21:41
崔永霞: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2013-05-22 09:25:06
最好先不加酶切位点，等基因扩增出来后再设计包含酶切位点的引物，这样做出来的几率大点，毕竟你是根据近缘种属设计的引物去做反转录。
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2楼2013-05-21 20:48:20
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-05-21 20:48:20
最好先不加酶切位点，等基因扩增出来后再设计包含酶切位点的引物，这样做出来的几率大点，毕竟你是根据近缘种属设计的引物去做反转录。

首先感谢前辈的指点，我刚开始做这块有点陌生。那如果我有这个酶的全长cDNA序列，（是同一个物种，但不是同一个品种），是不是可以根据这个cDNA序列设计引物，然后反转录呢？因为同源比对的话，我在NCBI近缘种属里面只找到两个序列，我觉得两个序列比对时不是不可靠？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
3楼2013-05-22 09:24:19
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
崔永霞: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2013-05-22 12:34:36
引用回帖:
3楼: Originally posted by 崔永霞 at 2013-05-22 09:24:19
首先感谢前辈的指点，我刚开始做这块有点陌生。那如果我有这个酶的全长cDNA序列，（是同一个物种，但不是同一个品种），是不是可以根据这个cDNA序列设计引物，然后反转录呢？因为同源比对的话，我在NCBI近缘种属里 ...

可以试试，有希望P出来，做这种实验看运气。
还有一个方法，就是找不同来源的这种酶，分析序列，看看有没有保守序列，然后根据保守序列设计引物去扩增。
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4楼2013-05-22 10:22:40
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-05-22 10:22:40
可以试试，有希望P出来，做这种实验看运气。
还有一个方法，就是找不同来源的这种酶，分析序列，看看有没有保守序列，然后根据保守序列设计引物去扩增。...

前辈你好，再弱弱的问一句，一般一个具有催化活性的酶，那个区域是最保守的？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
5楼2013-05-22 12:38:06
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 崔永霞 at 2013-05-22 12:38:06
前辈你好，再弱弱的问一句，一般一个具有催化活性的酶，那个区域是最保守的？...

不一定的，每类酶都有自己的特点，而且有些酶除了催化位点外，几乎没有保守性。你先查查自己酶是否有保守区域。
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6楼2013-05-22 18:28:15
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-05-22 18:28:15
不一定的，每类酶都有自己的特点，而且有些酶除了催化位点外，几乎没有保守性。你先查查自己酶是否有保守区域。...

哦，那查这个酶的保守区域和比对序列找保守区域有什么不同吗？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
7楼2013-05-22 20:09:02
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