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夏天的普洱茶木虫 (著名写手)
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[求助]
目的片段和T载体连接后PCR条带诡异
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| 我的目的片段大概有1200左右，连接到T载体后做蓝白斑筛选，挑取多个白斑提取质粒以后做PCR，结果P出来3条条带，分别是500，1500，3000，有人知道这是什么情况吗？求解答 |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
夏天的普洱茶: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-05-22 13:41:22
感谢参与，应助指数 +1
夏天的普洱茶: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-05-22 13:41:22
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推测原因: 1) 不是单菌落扩增结果?! 2) 引物扩增不特异!你的引物在片段上和载体上都有,不是载体上引物吧? 建议: 1) 载体说明上应该有检测引物序列RV-M/M13-47,用这对引物扩增检测试一试吧! 2) 或提出质粒后直接酶切鉴定,就可以,判定是否含目的基因. 3) 如果就想PCR鉴定,请设定对照或心中有数: 考虑一下你的质粒全长多少? 质粒全长: pMD19-T 约2700bp+片段1200bp?=3900bp? 空载应该扩出多大片段?(扩增时可以用空载质粒做个阴性对照) 目的质粒应该扩出多大片段? 设定对照再分析就容易找出原因! |
13楼2013-05-22 13:15:47
stevenshi021
新虫 (小有名气)
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2楼2013-05-20 11:12:34
3楼2013-05-20 11:27:49
夏天的普洱茶
木虫 (著名写手)
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4楼2013-05-20 13:20:52