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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » miRNA做完荧光定量需要跑焦吗？
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炭笔橡皮

新虫 (初入文坛)

[求助] miRNA做完荧光定量需要跑焦吗？

我反转录时用的颈环引物，real-time用的Taqman探针，特异性方面应该没问题吧，但是做了一个无模板对照竟然也有产物，所以其他的结果也都不可靠了，就想跑焦看一下片段长度。（虽然也可能是样太多我加错了，不过可能性不大）
但是跑焦的话目的片段应该是有多长呢？用的产品里面没有说明各种引物的长度，我查了一些别人做的引物设计，好像最终结果是比原有的miRNA长40bp，是这样吗？
还有就是用聚丙烯酰胺凝胶电泳的话多大浓度合适？
在此请教各位，望不吝赐教，谢谢！！
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1楼 2013-05-16 17:03:55
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炭笔橡皮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-16 17:25:33
楼主你要自己计算, 这个说不准的. 楼主需要知道你检测的miRNA序列, 颈环引物序列, 以及最后的PCR引物序列.

我又查了一下，它给出的stem-loop sequence 是UGUGUGCAUCCGGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUUUAGAGUUACACCCUGGGAGUUAACUGUACAACCUUCUAGCUUUCCUUGGAGCACACU
mature miRNA是 CUGUACAACCUUCUAGCUUUCC
它的颈环里面怎么还包含mature miRNA呢，而且3末端也没有与miRNA互补的序列
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3楼2013-05-16 19:01:49
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你要自己计算, 这个说不准的. 楼主需要知道你检测的miRNA序列, 颈环引物序列, 以及最后的PCR引物序列.
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2楼2013-05-16 17:25:33
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-05-16 22:46:43
引用回帖:
3楼: Originally posted by 炭笔橡皮 at 2013-05-16 19:01:49
我又查了一下，它给出的stem-loop sequence 是UGUGUGCAUCCGGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUUUAGAGUUACACCCUGGGAGUUAACUGUACAACCUUCUAGCUUUCCUUGGAGCACACU
mature miRNA是 CUGUACAACCUUCUAGCUUUCC
它的颈环里面怎么还包 ...

楼主这个不像是引物啊, 像是一个miRNA前体.
你可以把你的"引物"序列用网上预测RNA折叠的工具看看, 比如:
http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi
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4楼2013-05-16 20:30:56
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炭笔橡皮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-16 20:30:56
楼主这个不像是引物啊, 像是一个miRNA前体.
你可以把你的"引物"序列用网上预测RNA折叠的工具看看, 比如:
http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi...

好的，谢谢！
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5楼2013-05-17 14:47:26
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