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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 耐盐碱菌全蛋白跑2D
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Arsene_Lupin

铜虫 (小有名气)

[求助] 耐盐碱菌全蛋白跑2D

最近在学习双向电泳技术，帮老师跑蛋白。最近拿到一株耐盐碱菌株，提取总蛋白后跑2D（GE），3-10，18cm胶条，正常电聚焦后胶条不是应该从溴酚蓝色变成无色么，可是这几个样阳性端是无色，阴性端还是蓝色，且胶条厚度明显看出蓝色端厚于白色端，老师的几个样品完全变成无色。请教各位虫友可能的原因及解决之道。（此菌之前培养条件是10%Nacl，pH10）

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1楼 2013-05-16 13:44:33
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Arsene_Lupin

铜虫 (小有名气)
木有人回复呢！顶起来！

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2楼2013-05-16 23:29:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是上样量太大，超过胶条的溶胀能力了？
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3楼2013-05-17 08:59:22
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Arsene_Lupin

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-17 08:59:22
会不会是上样量太大，超过胶条的溶胀能力了？

每次都是350ul啊，其他都没问题的

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4楼2013-05-17 15:22:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by Arsene_Lupin at 2013-05-17 15:22:12
每次都是350ul啊，其他都没问题的
...

嗯。我一般上300μl。你的样品是否做了超速离心？有时候样品中的大颗粒也可能阻碍溶胀和电泳。
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5楼2013-05-18 00:54:31
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Arsene_Lupin

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-18 00:54:31
嗯。我一般上300μl。你的样品是否做了超速离心？有时候样品中的大颗粒也可能阻碍溶胀和电泳。...

影响会很大么？因为用的是生工的细菌蛋白提取试剂盒，最后一步是3000r取上清，但是之前有用pbs洗，12000离心

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6楼2013-05-18 07:17:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by Arsene_Lupin at 2013-05-18 07:17:08
影响会很大么？因为用的是生工的细菌蛋白提取试剂盒，最后一步是3000r取上清，但是之前有用pbs洗，12000离心
...

要看是什么样品了，如果是可溶蛋白的话，问题不是很大。有些样品疏水性蛋白多，不做超速离心会出问题。而且，样品经过超速离心会看到有少量沉淀的。
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7楼2013-05-19 03:12:40
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Arsene_Lupin

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-19 03:12:40
要看是什么样品了，如果是可溶蛋白的话，问题不是很大。有些样品疏水性蛋白多，不做超速离心会出问题。而且，样品经过超速离心会看到有少量沉淀的。...

这就是问题所在了，我提的是总蛋白，虽说耐盐菌会有些pI很高的蛋白但不至于一个点都没有吧，正常蛋白是不是也可以在胶条上分开？如果一些蛋白pI很高，超过胶条范围，不也应该跑到胶条的端点么？二向反映出来在端位会有大片纵带吧？这个样品浓度不高，不超过10，我按500ug／ml上样，考染后银染一点反映没有。因为需要达到500的浓度，所以350体系的话水化液的量会很少，我在想会不会水化不完全的关系？

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8楼2013-05-19 05:21:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by Arsene_Lupin at 2013-05-19 05:21:10
这就是问题所在了，我提的是总蛋白，虽说耐盐菌会有些pI很高的蛋白但不至于一个点都没有吧，正常蛋白是不是也可以在胶条上分开？如果一些蛋白pI很高，超过胶条范围，不也应该跑到胶条的端点么？二向反映出来在端位 ...

水化时样品的体积不宜超过水化液的1/10，否则会影响水化效果。如果样品太稀的话可以先沉淀蛋白样品后直接用水化液溶解样品。此外如果样品集中在pI较高的范围，你可以试试换一下胶条的pH范围。
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9楼2013-05-19 12:16:27
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Arsene_Lupin

铜虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-19 12:16:27
水化时样品的体积不宜超过水化液的1/10，否则会影响水化效果。如果样品太稀的话可以先沉淀蛋白样品后直接用水化液溶解样品。此外如果样品集中在pI较高的范围，你可以试试换一下胶条的pH范围。...

恩恩，多谢指导，我再研究下。请问有没有这方面较详细的书或pdf可以推荐下？
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10楼2013-05-19 20:51:01
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