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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR 滞孔
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蓝慧

木虫 (正式写手)

[求助] PCR 滞孔

各位虫子，最近做PCR实在是头痛，重复了几次都是这样的。求各位好心的虫子帮帮忙，看下是什么原因。

用的酶是Takara PrimeStar Max Premix, 体系为20ul, 引物0.4ul.
反应条件是94度3min, 98度10s, 55-58度均试过 15s, 72度1min, 35cycles.目的片段长度是1800bp,

望各位虫子多多发表意见。

玉米根系PCR.jpg
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向着目标前进！
1楼 2013-05-15 22:07:37
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wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2013-05-16 16:21:59
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-18 16:56:54
模版是什么？看图感觉啥都没有扩出来，孔里亮是蛋白污染
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2楼2013-05-15 22:08:44
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sunnyboylg

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧(myprayer代发): 金币+1, 感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:35
蓝慧: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-16 16:22:17
目的基因根本没p出来嘛。原因：1退火温度过高，试试52，50，48的；2退火时间改30s；3延伸时间2min。祝楼主能成功，pcr扩增本来就的慢慢来的。
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要么读书，要么旅行，身体和灵魂，必须有一个在路上
3楼2013-05-15 22:24:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:45
蓝慧: 金币+2 2013-05-16 16:23:15
感觉模板加多了，PCR产物电泳一般看不到模板。点样孔附近的亮带是模板里的DNA蛋白复合物。
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4楼2013-05-16 06:52:26
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wxl007777 at 2013-05-15 23:08:44
模版是什么？看图感觉啥都没有扩出来，孔里亮是蛋白污染

模板是基因组DNA
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向着目标前进！
5楼2013-05-16 16:21:13
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sunnyboylg at 2013-05-15 23:24:51
目的基因根本没p出来嘛。原因：1退火温度过高，试试52，50，48的；2退火时间改30s；3延伸时间2min。祝楼主能成功，pcr扩增本来就的慢慢来的。

我试试，谢谢意见
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6楼2013-05-16 16:21:41
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-16 07:52:26
感觉模板加多了，PCR产物电泳一般看不到模板。点样孔附近的亮带是模板里的DNA蛋白复合物。

OK，我试下把模板降低下。3Q
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向着目标前进！
7楼2013-05-16 16:22:59
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wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-18 16:57:08
引用回帖:
5楼: Originally posted by 蓝慧 at 2013-05-16 16:21:13
模板是基因组DNA...

DNA提取效果如何？另外必须先确认下引物有效，你是自己设计的引物，文献中查阅的，还是随机引物？
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8楼2013-05-16 17:39:32
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wxl007777 at 2013-05-16 18:39:32
DNA提取效果如何？另外必须先确认下引物有效，你是自己设计的引物，文献中查阅的，还是随机引物？...

DNA用nano drop和电泳检测过，没有问题。含量在150ng/ul左右。引物是文献中查阅的，引物以前也一直在用，用别的样品扩增是没有问题的，只不过是换了酶与样品
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9楼2013-05-16 18:03:41
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wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝慧 at 2013-05-16 18:03:41
DNA用nano drop和电泳检测过，没有问题。含量在150ng/ul左右。引物是文献中查阅的，引物以前也一直在用，用别的样品扩增是没有问题的，只不过是换了酶与样品...

那不要换酶试试看，或者用原来的样品现在的酶试试看
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10楼2013-05-16 22:45:33
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