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光树林

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2013-05-17 16:44:15
可以把预变性温度提高至98度，延伸时间延长至2min试试看
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一路向北
11楼2013-05-16 23:01:04
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你电泳是什么条件？因为1800 bp的条带比较长，需要高电压、长时间的电泳才能区分
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12楼2013-05-17 11:17:51
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-17 16:43:01
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-18 16:57:30
这种酶质量不错，可以直接采用两步法试试，98℃ 10s，72℃ 30s，循环35个，再不行就加入5%的DMSO试试，应该可以的。如果还是有问题，就考虑模板的质量。
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13楼2013-05-17 15:16:07
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by joan198108 at 2013-05-17 16:16:07
这种酶质量不错，可以直接采用两步法试试，98℃ 10s，72℃ 30s，循环35个，再不行就加入5%的DMSO试试，应该可以的。如果还是有问题，就考虑模板的质量。

倒是从来没有加过DMSO试过，我试一下，谢谢意见
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向着目标前进！
14楼2013-05-17 16:42:53
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by txw87 at 2013-05-17 12:17:51
你电泳是什么条件？因为1800 bp的条带比较长，需要高电压、长时间的电泳才能区分

130V，30min
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向着目标前进！
15楼2013-05-17 16:43:27
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 光树林 at 2013-05-17 00:01:04
可以把预变性温度提高至98度，延伸时间延长至2min试试看

预变性温度会影响很大吗？
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向着目标前进！
16楼2013-05-17 16:44:08
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by joan198108 at 2013-05-17 16:16:07
这种酶质量不错，可以直接采用两步法试试，98℃ 10s，72℃ 30s，循环35个，再不行就加入5%的DMSO试试，应该可以的。如果还是有问题，就考虑模板的质量。

再问下，加5%的DMSO多少呢，没接触过这东西，还真有点不明白。这个是体积比吗？
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向着目标前进！
17楼2013-05-17 17:25:48
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光树林

木虫 (著名写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-18 16:57:45
引用回帖:
16楼: Originally posted by 蓝慧 at 2013-05-17 16:44:08
预变性温度会影响很大吗？...

我是这样做就扩出来的，在不知道原因的时候，可以试试，感觉效果会好点，呵呵，可能是心理作用。。。当然心情好，说不定就p出来咯

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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一路向北
18楼2013-05-17 20:19:44
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 光树林 at 2013-05-17 21:19:44
我是这样做就扩出来的，在不知道原因的时候，可以试试，感觉效果会好点，呵呵，可能是心理作用。。。当然心情好，说不定就p出来咯
...

原来如此
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向着目标前进！
19楼2013-05-17 20:21:42
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txw87

木虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-18 16:58:02
引用回帖:
15楼: Originally posted by 蓝慧 at 2013-05-17 16:43:27
130V，30min...

哦，电泳条件应该是没啥问题了。

关于Taq酶延伸速度，大概是1000 bp/min，关于这个酶我查了下TaKaRa的说明书，延伸速度与Taq酶是一样的，而你的目的片段长度为1800 bp，延伸时间1 min显然有点短，可以参考其他虫友所说的2 min延伸甚至2 min30 s，变性时间及退火时间变为原来1.5-2倍。

长于1000 bp的片段一般都比较难扩，慢慢来，一定没有问题！

PS：TaKaRa的酶说老实话比较一般，这个酶的Mix也没说特别适用于长片段扩增，所以效果很难讲啊！
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20楼2013-05-18 01:54:01
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