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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR 滞孔
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蓝慧

木虫 (正式写手)

[求助] PCR 滞孔

各位虫子，最近做PCR实在是头痛，重复了几次都是这样的。求各位好心的虫子帮帮忙，看下是什么原因。

用的酶是Takara PrimeStar Max Premix, 体系为20ul, 引物0.4ul.
反应条件是94度3min, 98度10s, 55-58度均试过 15s, 72度1min, 35cycles.目的片段长度是1800bp,

望各位虫子多多发表意见。

玉米根系PCR.jpg
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向着目标前进！
1楼 2013-05-15 22:07:37
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txw87

木虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-18 16:58:02
引用回帖:
15楼: Originally posted by 蓝慧 at 2013-05-17 16:43:27
130V，30min...

哦，电泳条件应该是没啥问题了。

关于Taq酶延伸速度，大概是1000 bp/min，关于这个酶我查了下TaKaRa的说明书，延伸速度与Taq酶是一样的，而你的目的片段长度为1800 bp，延伸时间1 min显然有点短，可以参考其他虫友所说的2 min延伸甚至2 min30 s，变性时间及退火时间变为原来1.5-2倍。

长于1000 bp的片段一般都比较难扩，慢慢来，一定没有问题！

PS：TaKaRa的酶说老实话比较一般，这个酶的Mix也没说特别适用于长片段扩增，所以效果很难讲啊！
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20楼2013-05-18 01:54:01
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wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2013-05-16 16:21:59
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-18 16:56:54
模版是什么？看图感觉啥都没有扩出来，孔里亮是蛋白污染
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2楼2013-05-15 22:08:44
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sunnyboylg

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧(myprayer代发): 金币+1, 感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:35
蓝慧: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-16 16:22:17
目的基因根本没p出来嘛。原因：1退火温度过高，试试52，50，48的；2退火时间改30s；3延伸时间2min。祝楼主能成功，pcr扩增本来就的慢慢来的。
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要么读书，要么旅行，身体和灵魂，必须有一个在路上
3楼2013-05-15 22:24:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:45
蓝慧: 金币+2 2013-05-16 16:23:15
感觉模板加多了，PCR产物电泳一般看不到模板。点样孔附近的亮带是模板里的DNA蛋白复合物。
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4楼2013-05-16 06:52:26
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